湖南大圍子豬SLADR基因克隆及其生物信息學分析

1、湖南大圍子豬SLADR基因克隆及其生物信息學分析 11-01-28 10:45:00 編輯：studa20 作者：王燕, 邢曉為, 薛立群, 黃生強, 吳曉麗, 王維【摘要】 目的: 研究湖南大圍子豬SLADR基因特性, 評價該豬種在異種器官移植中是否具有應用前景。方法: 應用RTPCR擴增大圍子豬SLADRA和SLADRB基因, 插入pUCMT載體, 雙向測序, 用NCBI中的BLAST和ExPASY軟件進行生物信息學分析。結果: 大圍子豬SLADRA和SLADRB基因擴增片段大小分別為1 177 bp和909 bp, 均包含完整的開放閱讀框, 分別編碼252和266個氨基酸殘基。生物信息學

2、分析結果表明, 大圍子豬SLADRA和SLADRB與人類相應的DRA、 DRB相比, 氨基酸同源性分別為82%和73%。SLA DR 鏈與人CD4 分子結合部位介于第124 至136 位氨基酸, 大圍子豬SLADRA在該結合區(qū)域與人類相應的DRA存在兩個氨基酸差異, 即: 第127位(lleVal), 第136位(SerThr); SLA DR 鏈與人CD4 分子結合部位位于第134至148位氨基酸, 大圍子豬SLADRB在該結合區(qū)域與人類相應的DRB相比氨基酸序列完全相同。與國際GenBank 已登錄的許多豬種相比, SLADRA基因同源性高達100%, 而SLADRB基因在各豬種之間具有很

3、高的多態(tài)性。結論: 克隆湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因, 該基因與人類相應的HLADRA和HLADRB基因高度同源, 提示該豬種有望作為異種移植的候選供體。 【關鍵詞】 SLADR基因; 湖南大圍子豬; 基因克隆; 異種移植Abstract AIM: To evaluate the potential of Daweizi pigs as xenotransplantation dnors from pigs to humans by analyzing the characteristics of SLADR genes in Hunan Daweizi pigs. METHOD

4、S: SLADRA and SLADRB genes were amplified by RTPCR, cloned into pUCmT vectors, sequenced and analyzed through BLAST in NCBI and related software in ExPASY. RESULTS: The SLADRA and SLADRB genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length, which contain opening reading frame (ORF) and encode 252 an

5、d 266 amino acids respectively. Comparing the SLADRA and SLADRB genes with their counterpart sequences of human, the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. The amino acids in SLA DR chain of Daweizi pigs from position 124 to 136, which bind to human CD4, showed only two di

6、fferences with HLA DRA: a lleVal change at position 127 and a SerThr change at position 136. The amino acids in SLA DR chain of Daweizi pigs from position 134 to 148, which bind to human CD4, were identical with HLADRB. Further comparison with SLA sequences published in GenBank indicated that SLADRB

7、 gene found in Daweizi pigs has polymorphism while the homology of SLADRA gene is up to 100%. CONCLUSION: The cloned SLADRA and SLADRB in Hunan Daweizi pigs has high polymorphism with HLADRA and HLADRB in Human, indicates that Daweizi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs

8、to humans.KeywordsSwine leukocyte antigen DR allele (SLADR); Daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation同種異體器官移植已成為治療終末期器官衰竭的一種有效手段, 豬被認為是異種移植最理想的供體來源1。然而, 如何解決免疫排斥問題仍是阻礙臨床大規(guī)模應用的主要問題之一2。豬的主要組織相容性復合體(majorhistocompatibility complex, MHC), 又稱作豬白細胞抗原(swine leukocte antigen, SLA), 是由緊密連鎖的高度多態(tài)基因座所組成的

9、染色體的一個遺傳區(qū)域, 它作為主要組織抗原, 參與移植排斥反應, 是引起異種移植急性細胞性排斥的主要遺傳因素3。通過對供體豬種進行篩查, 盡可能選擇與人類MHC同源性較高的豬種將有助于提高異種移植物在人體內的存活時間, 為臨床大規(guī)模開展將豬器官或細胞異種移植到人提供理想的供體豬種來源。中國具有豐富的豬種種質資源, 不同的地域分布形成了豬種的多樣性和遺傳的相對穩(wěn)定性, 為異種移植提供了可貴的研究和利用資源4。湖南大圍子豬是我國特有的地方豬種之一, 亦是湖南省著名地方優(yōu)良豬種, 具有繁殖力強、 抗逆性強、 耐粗飼、 肉質好、 生長慢、 飼料效率高等種質性狀。但是, 大圍子豬能否作為異種移植的供體,

10、 尤其是該豬種細胞表面SLA特性如何, 目前尚不清楚。本研究將克隆湖南大圍子豬SLADR基因, 分析其SLADRA和SLADRB基因特性, 比較與人CD4 分子結合部位大圍子豬SLADR編碼氨基酸與人類相應DRA、 DRB的同源性, 為評價湖南大圍子豬在異種移植中的應用前景, 提供免疫學方面的依據。1 材料和方法1.1 材料 總RNA抽提試劑盒購自美國Gentra公司; cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas 公司; pUCMT載體、 引物、 電泳試劑等購自上海生工生物工程技術服務有限公司; PCR高保真克隆酶EasyA購自Stratagene公司; DNA marker(100 bp

11、 ladder)購自晶美生物工程公司; 湖南大圍子豬來自湖南望城大圍子豬保種基地。1.2 方法1.2.1 湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因引物設計 根據GenBank數據庫中已登錄的明尼蘇達小型豬(Minnesota miniature swine)的SLADR序列(登錄號為M93028, AB205163), 采用PCRDESN軟件設計以下引物。SLADRA: 上游引物 : 5GGC ATC TAA GGA GAA AAT GAC3; 下游引物: 5CCA CTC AAA GTT TAT TGT ATT CAG3, 預計擴增片段大小為1 177 bp; SLADRB: 上游引物:

12、5TTG TCC TCT CCT GTT CTC CAG3; 下游引物: 5TAG GAC GCA GAG CAT AGC AGG3, 預計擴增片段大小為909 bp。1.2.2 RTPCR擴增湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因 在湖南大圍子豬保種群中隨機挑選兩頭個體, 以700 mL/L乙醇消毒耳尖取耳樣組織, 按RNA抽提試劑盒(Gentra公司)說明書方法提取總RNA。測定每一樣品總RNA的濃度, 模板定量為1 g RNA, 按RevertAidTM First strand cDNA Synthesis kit說明書方法逆轉錄合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板進行PCR

13、擴增, 20 L PCR反應體系中, 分別加入下列物質: DEPC處理水13.5 L, PCR緩沖液2 L, 25 mmol/L MgCl2 1.6 L, 10 mmol/L dNTP混合物0.5 L, 50 mmol/L上、 下游引物各0.2 L, 模板1.6 L, EasyA 高保真酶0.4 L。在PE9700 型PCR 擴增儀上完成PCR擴增, 擴增條件如下: 先95預變性2 min 30 s, 94變性40 s, 5859退火40 s, 72延伸40 s, 完成35個循環(huán), 最后72延伸5 min, 置 4保溫。取3.5 L PCR擴增產物, 1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 以鑒定PC

14、R擴增結果。1.2.3 湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因克隆與鑒定 連接反應在10 L體系中進行: 雙蒸水3 L、 PCR產物1 L、 pUCmT載體1 L混勻后加入5 L Solution, 16水浴連接過夜, 轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109(采用CaCl2法制備), 4靜置30 min后放入42水浴中熱休克90 s, 加入300 L預熱的LB培養(yǎng)基, 37下振蕩培養(yǎng)(200 r/min) 45 min, 將菌液平鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上, 37恒溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆, 在含氨芐青霉素200 mg/L的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng), 以菌液為模板, PCR鑒定為陽性克隆, 抽提質

15、粒, 送上海英駿生物技術有限公司雙向測序。1.2.4 湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因生物信息學分析 用NCBI Homepage中的ORF對湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因的開放閱讀框進行識別; 用ExPASY服務器中的PROSITE SCAN軟件對SLADRA和SLADRB基因的功能域進行預測; 用NCBI中的BLAST及ExPASY服務器中的CLUSTALW等軟件對獲得的SLADRA和SLADRB基因的序列結構進行比較分析。2 結果2.1 湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB基因RTPCR擴增結果 RTPCR擴增結果顯示, 兩頭湖南大圍子豬SLADRA和SLADRB

16、均有特異性擴增條帶, 大小分別為1 177 bp和909 bp, 與預期擴增片段大小一致(圖1)。2.2 湖南大圍子豬SLADRA基因測序結果 測序大圍子豬SLADRA基因, 結果表明: 來源于兩個不同個體的SLADRA基因序列是一致的, 其cDNA全長均為1 177 bp, 包含一個759 bp的完整的開放閱讀框, 推測編碼252個氨基酸。生物信息分析發(fā)現, SLADRA第123 位氨基酸為信號肽, 第24107位氨基酸為1 功能區(qū), 第108202位氨基酸為2 功能區(qū), 第203252位氨基酸為穿膜和胞漿功能區(qū)。推測SLADRA蛋白中有1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點, 6個N肉蔻?；稽c, 2個N糖基化位點, 2個蛋白激酶C磷酸化位點, 1個酪蛋白激酶磷酸化位點。2.3 湖南大圍子豬SLADRB測序結果 測序大圍子豬SLADRB基因, 結果表明: 來源于兩個不同個體的SLADRB基因序列是一致的, 其cDNA 全長為909 bp, 包含一個完整的開放閱讀框, 大小為801 bp, 推測編碼266個氨基酸。生物信息分析發(fā)現, SLADRB蛋白序列第129 位氨基酸為信號肽, 第30123 位氨基酸為1 功能區(qū), 第124217 位氨基酸為2 功能區(qū), 第218266位氨基酸為穿膜和胞質功能區(qū)。推