熒光定量PCR技術(shù)培訓(xùn)-康為

1、實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù)原理、應(yīng)用及實(shí)踐原理、應(yīng)用及實(shí)踐(Real time Quantitative PCR)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司北京康為世紀(jì)生物科技有限公司Real time Quantitative PCR2 2北京康為世紀(jì)生物科技有限公司北京康為世紀(jì)生物科技有限公司v我們的目標(biāo)：中國的我們的目標(biāo)：中國的Invitrogen v完善的產(chǎn)品線完善的產(chǎn)品線v一站式的服務(wù)平臺一站式的服務(wù)平臺3北京康為世紀(jì)生物科技有限公司北京康為世紀(jì)生物科技有限公司v核酸提取核酸提取vPCR、RT-PCR 及熒光定量及熒光定量PCRvDNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)v克隆與轉(zhuǎn)化克隆與轉(zhuǎn)化

2、v蛋白提取與純化蛋白提取與純化v蛋白定量、蛋白蛋白定量、蛋白Marker及蛋白電泳產(chǎn)品及蛋白電泳產(chǎn)品vWestern Blot產(chǎn)品產(chǎn)品v免疫組化產(chǎn)品、免疫沉淀免疫組化產(chǎn)品、免疫沉淀v標(biāo)簽抗體標(biāo)簽抗體v內(nèi)參抗體內(nèi)參抗體v二抗二抗完善的產(chǎn)品線完善的產(chǎn)品線4五大平臺五大平臺 一站式服務(wù)一站式服務(wù)5園區(qū)公共服園區(qū)公共服務(wù)平臺務(wù)平臺2010年康為世紀(jì)公司依托江蘇年康為世紀(jì)公司依托江蘇省泰州市政府及中國醫(yī)藥城的省泰州市政府及中國醫(yī)藥城的支持政策，成立江蘇康為世紀(jì)，支持政策，成立江蘇康為世紀(jì)，主要進(jìn)行創(chuàng)新的臨床診斷試劑主要進(jìn)行創(chuàng)新的臨床診斷試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與相應(yīng)的技術(shù)服的研發(fā)、生產(chǎn)與相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)，務(wù)，占地

3、面積約占地面積約3300平米平米2700平米的實(shí)驗(yàn)區(qū)平米的實(shí)驗(yàn)區(qū): 臨床生化診斷試劑研發(fā)平臺臨床生化診斷試劑研發(fā)平臺免疫診斷試劑研發(fā)平臺免疫診斷試劑研發(fā)平臺分子診斷試劑研發(fā)平臺分子診斷試劑研發(fā)平臺免疫組化診斷試劑研發(fā)平臺免疫組化診斷試劑研發(fā)平臺約約300平米平米GMP標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)車間標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)車間總投資總投資6500萬元萬元泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺 6熒光定量熒光定量PCR儀儀芯片點(diǎn)樣儀芯片點(diǎn)樣儀芯片掃描儀芯片掃描儀全自動核酸全自動核酸提取儀提取儀超速離心機(jī)超速離心機(jī) 焦磷酸焦磷酸DNA測序儀測序儀分子生物學(xué)平臺

4、分子生物學(xué)平臺凝膠成像儀凝膠成像儀泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺 芯片雜交儀芯片雜交儀康為世紀(jì)生物科技有限公司康為世紀(jì)生物科技有限公司7完善的產(chǎn)品線完善的產(chǎn)品線v分子生物學(xué)分子生物學(xué) 全系列產(chǎn)品全系列產(chǎn)品v蛋白質(zhì)學(xué)產(chǎn)品蛋白質(zhì)學(xué)產(chǎn)品v免疫學(xué)相關(guān)產(chǎn)品免疫學(xué)相關(guān)產(chǎn)品一站式服務(wù)平臺一站式服務(wù)平臺v實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)平臺實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)平臺v分子生物學(xué)平臺分子生物學(xué)平臺v蛋白表達(dá)與純化蛋白表達(dá)與純化 平臺平臺v抗體制備純化平臺抗體制備純化平臺v免疫學(xué)檢測平臺免疫學(xué)檢測平臺北京康為世紀(jì)生物科技有限公司北京康為世紀(jì)生物科技有限公司我們的客戶我們的客

5、戶我們的合作伙伴我們的合作伙伴v北京大學(xué)、清華大學(xué)、北京大學(xué)、清華大學(xué)、 復(fù)旦大學(xué)等復(fù)旦大學(xué)等v中國科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院、中國科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院、 上海瑞金、軍事醫(yī)學(xué)上海瑞金、軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院科學(xué)院v301醫(yī)院、醫(yī)院醫(yī)院、醫(yī)院v華大基因、諾華制藥華大基因、諾華制藥v九強(qiáng)、博奧等九強(qiáng)、博奧等v a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB vState Key Laboratory o

6、f Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China v CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human Cells State Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

7、, Shanghai, Chinav Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in rats School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PRChinav Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field

8、on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cellsv CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science shanghai,china 主要內(nèi)容主要內(nèi)

9、容 Company nameReal-time qPCR的定量原理的定量原理2Real-time qPCR的檢測方法的檢測方法3Real-time qPCR的基本概念的基本概念 1Real-time qPCR的解析方法的解析方法 4PCRPCR：基本原理：基本原理Denaturation: 94 96CAnnealing: 50 65CExtension: 70 75C基本要素：基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T PCRPCR：基本原理：基本原理Company name理想的理想的PCR反應(yīng)：反應(yīng)： N=N0*2n實(shí)

10、際的實(shí)際的PCR反應(yīng)：反應(yīng)： N=N0* (1+E)nN0：初始模板量：初始模板量N：第：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量次循環(huán)后的產(chǎn)物量 n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) E：擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率S形曲線，具有平臺效應(yīng)形曲線，具有平臺效應(yīng)Company name 與普通與普通PCRPCR的對比的對比同一個(gè)樣本進(jìn)行同一個(gè)樣本進(jìn)行9696次重復(fù)次重復(fù)傳統(tǒng)傳統(tǒng)PCR檢測檢測Real time PCR Real time PCR 檢測檢測v Real time PCR-Real time PCR-起點(diǎn)檢測起點(diǎn)檢測： - - 起點(diǎn)量是樣本中起始的起點(diǎn)量是樣本中起始的DNADNA量量- - “加入了加入了5

11、00500個(gè)拷貝個(gè)拷貝”- - 具有重現(xiàn)性，誤差小具有重現(xiàn)性，誤差小v 傳統(tǒng)傳統(tǒng)PCR-PCR-終點(diǎn)檢測終點(diǎn)檢測： - - 終點(diǎn)產(chǎn)物量經(jīng)過終點(diǎn)產(chǎn)物量經(jīng)過PCRPCR放大的放大的DNADNA量量- - “生成了生成了500500，00000000，00000000個(gè)拷貝個(gè)拷貝”- - 不恒定，誤差大不恒定，誤差大傳統(tǒng)傳統(tǒng)PCR檢測檢測Real-time qPCR激發(fā)光激發(fā)光發(fā)射光發(fā)射光- - 在在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)。反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)。- - 熒光基團(tuán)在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。熒光基團(tuán)在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。- - 利用熒光信號的變化動態(tài)監(jiān)測整個(gè)

12、反應(yīng)過程。利用熒光信號的變化動態(tài)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)過程。 熒光基團(tuán)熒光基團(tuán) 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線（primary curve）Company name擴(kuò)增曲線：擴(kuò)增曲線：隨著隨著PCRPCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度不斷增加。反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測擴(kuò)每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴(kuò)增曲線圖。增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴(kuò)增曲線圖?？v坐標(biāo)：Rn（熒光值） 橫坐標(biāo)：cycle number（循環(huán)數(shù)）線性圖線性圖對數(shù)圖對數(shù)圖Company name 熒光閾值（熒

13、光閾值（threshold）基線基線(baseline)(baseline)：一般以一般以PCRPCR反應(yīng)前反應(yīng)前1515個(gè)循環(huán)的熒光信號作為本底信號個(gè)循環(huán)的熒光信號作為本底信號熒光閥值熒光閥值(threshold)(threshold)：擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值- - 缺省設(shè)置：缺省設(shè)置：PCRPCR反應(yīng)前反應(yīng)前3-153-15個(gè)循環(huán)熒光本底信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的個(gè)循環(huán)熒光本底信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的1010倍倍- - 手動設(shè)置：大于樣本的熒光背景值手動設(shè)置：大于樣本的熒光背景值 Ct 值值(Cycle Threshold)Company nameCtCt值值：PCRPCR擴(kuò)增過程

14、中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，熒光值所對應(yīng)的設(shè)定的閾值時(shí)，熒光值所對應(yīng)的PCRPCR循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)。 起始模板量起始模板量 基線基線 閾值閾值 CtCt值值 Ct 值值(Cycle Threshold)Company nameCtCt值的特點(diǎn)值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行相同模板進(jìn)行9696次擴(kuò)增，平臺期次擴(kuò)增，平臺期DNADNA拷貝數(shù)波動拷貝數(shù)波動很大，但很大，但CtCt值相對固定；值相對固定；CtCt值則極具重現(xiàn)性值則極具重現(xiàn)性CtCt值可以確定初始模板量？值可以確定初始模板量？R Rn n=R=RB B+ X+ X0 0 (1+E)(1+E)N N

15、 * * R RS S第第n n個(gè)循環(huán)的總信號個(gè)循環(huán)的總信號 = =本底信號本底信號 + + 起始起始DNADNA數(shù)目數(shù)目 * * PCRPCR擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率 * * 單位信號強(qiáng)度單位信號強(qiáng)度當(dāng)循環(huán)次數(shù)當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ctn=Ct時(shí)時(shí)R RCtCt=R=RB B+ X+ X0 0 (1+E)(1+E)Ct Ct * * R RS S兩邊同時(shí)取對數(shù)得兩邊同時(shí)取對數(shù)得: :lg(Rlg(RCtCt-R-RB B)=lgX)=lgX0 0+Ctlg(1+E)+lgR+Ctlg(1+E)+lgRS SCt=-lgXCt=-lgX0 0/lg(1+E)+ lg(R/lg(1+E)+ lg(RCtCt-R

16、-RB B)-lgR)-lgRS S/lg(1+E)/lg(1+E) Ct=-klgXCt=-klgX0 0+b+bCompany namelgXlgX0 0與與CtCt值呈線性關(guān)系值呈線性關(guān)系根據(jù)根據(jù)CtCt值可以計(jì)算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù)值可以計(jì)算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù)起始拷貝數(shù)越多，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小。值越小。Company nameRn vs. Cycle number- Rn vs. Cycle number- 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線LogDNA vs. Ct - LogDNA vs. Ct - 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知未知10410310610510210標(biāo)準(zhǔn)曲

17、線標(biāo)準(zhǔn)曲線 (standard curve)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析標(biāo)準(zhǔn)曲線分析- - 對已知或未知樣本進(jìn)行系列濃度梯度稀釋對已知或未知樣本進(jìn)行系列濃度梯度稀釋y = -ax+b y = -ax+b 測定熒光定量測定熒光定量PCRPCR反應(yīng)的有效性反應(yīng)的有效性- - 線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線：相關(guān)系數(shù)線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線：相關(guān)系數(shù)R R2 2- - 擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率： 擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率(E)=10(E)=10-1/-1/斜率斜率-1 -1 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線分析分析 熒光定量熒光定量PCRPCR檢測方法檢測方法Company name染料標(biāo)記：染料標(biāo)記： SYBR Green Super green探針標(biāo)記：探針標(biāo)記：水

18、解探針：水解探針： TaqMan非水解探針：非水解探針：Molecular beacon Company nameSYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green ISYBR Green I 是是一種與雙鏈一種與雙鏈DNADNA小小溝結(jié)合的熒光染料。溝結(jié)合的熒光染料。l SYBR Green ISYBR Green I只只與雙鏈與雙鏈DNADNA結(jié)合才結(jié)合才能發(fā)出熒光。能發(fā)出熒光。l 熒光信號與雙鏈熒光信號與雙鏈DNADNA分子數(shù)成正分子數(shù)成正比，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物增加而增加。比，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物增加而增加。 熒光信號強(qiáng)度與反應(yīng)體系中熒光信號強(qiáng)度與反應(yīng)體系中所

19、有雙鏈所有雙鏈DNADNA分子成正比。分子成正比。5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitation- - 變性時(shí)，變性時(shí)，DNADNA雙鏈分開，無熒光信號。雙鏈分開，無熒光信號。- - 延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號。延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號。 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理 SYBR Green I SYBR Green I優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v 使用方便，成本低使用方便，成本低- - 僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物v 通用性好通用性好- - 對對DNADNA模板沒有選擇性模板沒有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對產(chǎn)物做融解曲線分析。需要

20、在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v SYBR GreenSYBR Green與所有雙鏈與所有雙鏈DNADNA結(jié)合結(jié)合- - 引物二聚體或錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)引物二聚體或錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物造成假陽性物造成假陽性- - 只能檢測單一模板，無法只能檢測單一模板，無法進(jìn)行多重檢測進(jìn)行多重檢測Company name 將溫度對熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。將溫度對熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)(-dI/dT) 融解曲線融解曲線 (dissociation curve) 確認(rèn)確認(rèn)PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性反應(yīng)產(chǎn)物的特異性 對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜 原始圖譜原始圖譜融解曲線分析融解曲線分析- - 非特異性產(chǎn)物非特異性

21、產(chǎn)物- - 引物二聚體引物二聚體 Taqman 工作原理工作原理v 探針與靶序列配對探針與靶序列配對 （一段序列，兩個(gè)基團(tuán)，（一段序列，兩個(gè)基團(tuán)，5 5 報(bào)告基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、3 3淬滅基團(tuán)）淬滅基團(tuán)）v 完整的探針，報(bào)告基團(tuán)完整的探針，報(bào)告基團(tuán)R R發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)QQ淬滅，淬滅， 沒有熒光產(chǎn)生。沒有熒光產(chǎn)生。v 聚合酶的聚合酶的5 5外切酶活性外切酶活性v 報(bào)告基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)R R與淬滅基團(tuán)與淬滅基團(tuán)QQ分離，發(fā)射熒光。分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號強(qiáng)度與結(jié)合探針的熒光信號強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNADNA分子成正比。分子成正比。 Taqma

22、n 工作原理工作原理 在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被探針被Taq酶的酶的5- 3 外切酶活性剪切成片斷外切酶活性剪切成片斷游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離在延伸過程中，探針部分與靶序列分離 SYBR Green I與與Taqman 對比對比Taqmanv特異性高特異性高- 與特異靶序列結(jié)合與特異靶序列結(jié)合v對模板有選擇性對模板有選擇性- 可進(jìn)行多重可進(jìn)行多重PCR反應(yīng)反應(yīng) SYBR Green Iv 使用方便，成本低使用方便，成本低- - 僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物v通用性好通用性好- - 對對DNADNA模板

23、沒有選擇性模板沒有選擇性 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法v絕對定量絕對定量 樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）- - 檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有60006000個(gè)拷貝個(gè)拷貝v相對定量相對定量 不同樣本中目的基因表達(dá)量的差異不同樣本中目的基因表達(dá)量的差異- - 腫瘤組織和正常組織相比腫瘤組織和正常組織相比 某個(gè)基因的表達(dá)量某個(gè)基因的表達(dá)量mRNAmRNA改變了多少倍，改變了改變了多少倍，改變了6060倍倍絕對定量絕對定量Sample- - 樣本起始濃度與樣本起始濃度與CtCt呈線性關(guān)系，根據(jù)已知拷貝的標(biāo)呈線性關(guān)

24、系，根據(jù)已知拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。- -根據(jù)未知樣品的根據(jù)未知樣品的CtCt值，推算出未知樣本量。值，推算出未知樣本量。以標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)桿以標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)桿絕對定量的步驟絕對定量的步驟拷貝數(shù)計(jì)算拷貝數(shù)計(jì)算對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度濃度稀釋對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度濃度稀釋熒光定量熒光定量PCR反應(yīng)反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)品未知樣品未知樣品Ct代入標(biāo)準(zhǔn)曲線代入標(biāo)準(zhǔn)曲線確定拷貝數(shù)確定拷貝數(shù)質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取OD值測定值測定計(jì)算樣本濃度計(jì)算樣本濃度/樣本分子量樣本分子量/樣本拷貝數(shù)樣本拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5-6個(gè)個(gè)梯度稀釋梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)為10絕對定量舉例絕對定量舉例CtCt值值

25、拷貝數(shù)拷貝數(shù)CtCt值值拷貝數(shù)拷貝數(shù)相對定量相對定量 參照樣本參照樣本 Calibrator用于比較結(jié)果的基準(zhǔn)。用于比較結(jié)果的基準(zhǔn)。35 相對定量相對定量 特點(diǎn)特點(diǎn)選擇內(nèi)參基因選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、 18S rRNA18S rRNA等等看家基因看家基因housekeepinggene在細(xì)胞中的表達(dá)量在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小因素影響較小- 文獻(xiàn)檢索文獻(xiàn)檢索- 實(shí)驗(yàn)篩選實(shí)驗(yàn)篩選內(nèi)參基因內(nèi)參基因- - 同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目不同。同樣體積或重量的樣本

26、所來源的細(xì)胞數(shù)目不同。- RNA- RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。對樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。對樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。2- Ct法法Company name成立條件：成立條件：假設(shè)擴(kuò)增效率為假設(shè)擴(kuò)增效率為100%滿足條件：滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近 2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率均為）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率均為90%-110%假設(shè)條件：假設(shè)條件： 內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異大于內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異大于5% 1）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使擴(kuò)增效率接近）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使

27、擴(kuò)增效率接近 2）使用其他方法）使用其他方法 相對定量方法相對定量方法 2- Ct法法 相對定量舉例相對定量舉例相對定量分析相對定量分析 待測樣品目的基因 濃度 待測樣品內(nèi)參基因 濃度 F= 對照樣品目的基因 濃度 對照樣品內(nèi)參基因 濃度假設(shè)條件：假設(shè)條件： 內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率不同內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率不同 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法80% 相對定量舉例相對定量舉例 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 流流 程程Company name SYBR Green法實(shí)驗(yàn)流程法實(shí)驗(yàn)流程

28、Company name樣本處理樣本處理RNARNA提取提取qPCR數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 樣本處理與樣本處理與RNA提取提取v 外界刺激 10min 可檢測的表達(dá)改變v 樣品離開定義環(huán)境 2min 裂解、固定細(xì)胞TRIzon（酚、異硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，異硫氰酸胍， SDS）液氮RNA保存液 v 小心DNA污染！使用DNase 陰性對照 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇逆轉(zhuǎn)錄引物選擇 下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？ Abundant RNA的干擾：mRNA or total RNA？ 檢測靈敏度是否足夠？ RT-PCR一步法還是兩步法？一步法還是兩步法？兩步法兩步法: : 反轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)

29、錄和PCRPCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。 步驟多但靈活多樣。步驟多但靈活多樣。cDNAcDNA可長期保留檢測可長期保留檢測 多個(gè)基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。在多個(gè)基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。在工作的初期。工作的初期。一步法：一步法：反轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄和PCRPCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成。擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成。 簡便、快捷但只做一個(gè)基因，一旦失敗簡便、快捷但只做一個(gè)基因，一旦失敗 難以查找原因。在工作的成熟階段。難以查找原因。在工作的成熟階段?？傇瓌t與普通總原則與普通PCRPCR相同：相同：v 避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)v 擴(kuò)增片段長度（擴(kuò)增片段長度（80 - 300bp)80 -

30、300bp)v 推薦做跨推薦做跨intronintron設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則Master mix的應(yīng)用的應(yīng)用使用使用Master mix有效降低系統(tǒng)誤差有效降低系統(tǒng)誤差- 熱啟動酶熱啟動酶 Hotstar 化學(xué)修飾，低溫下酶活抑制性強(qiáng)，熱復(fù)活需10min Fast Hotstar 抗體修飾，熱復(fù)活僅需幾十秒- Buffer 反應(yīng)增強(qiáng)劑反應(yīng)增強(qiáng)劑 減少模板二級結(jié)構(gòu)影響 控制Mg2+濃度 穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mixMaster mix的優(yōu)化的優(yōu)化新型熒光染料新型熒光染料(Super Green(Super Green)激發(fā)、

31、發(fā)射波長與激發(fā)、發(fā)射波長與SYBR GreenSYBR Green近似近似對對PCRPCR反應(yīng)抑制更輕微反應(yīng)抑制更輕微 可使用較高濃度可使用較高濃度(1uM, SYBR green (1uM, SYBR green 0.3uM)0.3uM)更亮，靈敏度更高更亮，靈敏度更高對小片段對小片段DNADNA和和ssDNAssDNA結(jié)合更弱結(jié)合更弱 減少背景，有效信號更強(qiáng)減少背景，有效信號更強(qiáng)化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定致突變性與毒性更弱致突變性與毒性更弱SYBR GreenSuper GreenMaster MixROX Passive Reference 不參與、不干擾不參與、不干擾PCRPCR反應(yīng)

32、反應(yīng) 恒定發(fā)射熒光信號恒定發(fā)射熒光信號 用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導(dǎo)致用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。的系統(tǒng)誤差。 有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。 誤差控制誤差控制v 使用使用Master mixv 配置預(yù)混體系配置預(yù)混體系v 設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體）設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）v 陽性和陰性對照陽性和陰性對照 實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制v 試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)v 核酸制備區(qū)核酸制備區(qū)v 反應(yīng)液制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)v 熒光定量熒光定量PCR反應(yīng)區(qū)反應(yīng)區(qū)熒光定量熒光定量PCRPCR體系體系 數(shù)據(jù)

33、分析數(shù)據(jù)分析 融解曲線：融解曲線：單一特異性產(chǎn)物單一特異性產(chǎn)物 擴(kuò)增曲線：擴(kuò)增曲線：- Ct- Ct值大小值大小- - 各復(fù)孔之間重復(fù)性各復(fù)孔之間重復(fù)性- - 不同濃度梯度稀釋的間隔性不同濃度梯度稀釋的間隔性 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線：- R- R2 20.9800.980或或 r r 0.9900.990- - 反應(yīng)效率盡可能高：反應(yīng)效率盡可能高：90%-110%90%-110%- - 目的基因的擴(kuò)增效率接近內(nèi)參基因目的基因的擴(kuò)增效率接近內(nèi)參基因Trouble shootingHousekeeping geneHousekeeping gene 無信號無信號RNARNA降解降解用新鮮組織提取用新鮮

34、組織提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信號有信號而目標(biāo)基因無信號而目標(biāo)基因無信號1. 1. 目的基因表達(dá)低。目的基因表達(dá)低。 逆轉(zhuǎn)錄效率不高逆轉(zhuǎn)錄效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。3. 3. 嘗試不同嘗試不同PCRPCR引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo) 區(qū)段，考慮不同剪接體。區(qū)段，考慮不同剪接體。4. 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。Hous

35、ekeeping geneHousekeeping gene反應(yīng)效率正常反應(yīng)效率正常, ,但但目標(biāo)因放大效率不高目標(biāo)因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，重新設(shè)計(jì)引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，考慮不同剪接體考慮不同剪接體目標(biāo)基因表達(dá)豐度在目標(biāo)基因表達(dá)豐度在樣本之間異常一致樣本之間異常一致RNARNA被基因組被基因組DNADNA污染污染1.1.使用跨使用跨intron intron 引物引物2.2.用用DNaseDNase處理處理RNARNA3.3.確保確保RNARNA陰性對照表現(xiàn)陰性陰性對照表現(xiàn)陰性溶解曲線出現(xiàn)雜峰溶解曲線出現(xiàn)雜峰1.1.出現(xiàn)非

36、特異出現(xiàn)非特異PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物2.2.出現(xiàn)引物二聚體出現(xiàn)引物二聚體1.1.嘗試不同嘗試不同PCRPCR引物引物2.2.嘗試不同熱循程序，升高復(fù)性溫度嘗試不同熱循程序，升高復(fù)性溫度3.3.修改儀器設(shè)置，將檢測溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈修改儀器設(shè)置，將檢測溫度設(shè)定在在引物二聚體解鏈溫度與溫度與PCRPCR特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。特異產(chǎn)物解鏈溫度之間。陰性對照在陰性對照在3030個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)以內(nèi)出現(xiàn)信號以內(nèi)出現(xiàn)信號試劑被污染試劑被污染1.1.注意區(qū)分信號是來自引物二聚體還是注意區(qū)分信號是來自引物二聚體還是PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物2.2.查找，替換污染試劑查找，替換污染試劑3.3.使用使用UNGUNG系

37、統(tǒng)。系統(tǒng)。qPCR反應(yīng)優(yōu)化反應(yīng)優(yōu)化非關(guān)鍵技術(shù)非關(guān)鍵技術(shù)外包服務(wù)外包服務(wù)Housekeeping gene 引物序列？反應(yīng)條件？目標(biāo)基因 引物序列？反應(yīng)條件？選擇試劑，摸索條件，優(yōu)化參數(shù) 兩個(gè)月？CoWin解決方案一：Primer assay 客戶指定：物種，housekeeping gene，目標(biāo)基因 客戶得到：經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、驗(yàn)證過的引物，反應(yīng)條件參數(shù)，MasterMix 客戶下游工作：Real-time PCR 數(shù)據(jù)獲取CoWin解決方案二：全套qPCR服務(wù) 客戶指定：物種，housekeeping gene，目標(biāo)基因 客戶提供：生物樣本 客戶得到：數(shù)據(jù)報(bào)告，剩余樣品。 客戶下游工作：寫論文;得諾貝爾獎試用裝領(lǐng)取試用裝領(lǐng)取v網(wǎng)上可以享受體驗(yàn)價(jià)vPCR mix 5ml v質(zhì)粒小提、膠回收質(zhì)粒小提、膠回收 基因組提取基因組提取 2盒盒vTRIzon RNA提取試劑vSYBR green 熒光定量mixvSYBR green 熒光定量mix（with ROX）vReal super 熒光定量mixvReal super 熒光定量mix（ with ROX ）vECL 化學(xué)發(fā)光