實(shí)驗(yàn)四同工酶分析

1、1實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 過(guò)氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝膠過(guò)氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳（PAGE）分析）分析2 （1）掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳（掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)的）技術(shù)的原理和操作方法。原理和操作方法。 （2）掌握）掌握PAGE法分離過(guò)氧化物同工酶的原理和法分離過(guò)氧化物同工酶的原理和方法。方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 過(guò)氧化物同工酶及活性染色過(guò)氧化物同工酶及活性染色二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 1、電泳、電泳概念概念：帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相：帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。反的電極移

2、動(dòng)的現(xiàn)象。 + +- -+ +- -二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 2、電泳、電泳分類分類：顯微電泳顯微電泳自由界面電泳自由界面電泳區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 紙電泳紙電泳 醋酸薄膜電泳醋酸薄膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 3、電泳法、電泳法原理原理：在一定條件下，任何帶點(diǎn)顆粒在一定條件下，任何帶點(diǎn)顆粒都有自己特定的電泳遷移率。影響電泳遷移率的都有自己特定的電泳遷移率。影響電泳遷移率的因素：因素：顆粒性質(zhì)顆粒性質(zhì)：凈電荷凈電荷數(shù)目、顆粒數(shù)目、顆粒大小大小、顆粒、顆粒形狀形狀電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度：V/cm溶液性質(zhì)：溶液性質(zhì)：緩沖液的

3、緩沖液的pH、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度、溶液黏度、溶液黏度、電滲電滲二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 4、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：是由是由單體單體丙烯酰胺丙烯酰胺（Acr）和和交聯(lián)劑交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在在加速劑加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺（TEMED）和和催催化劑化劑過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨（AP）的作用下聚合交聯(lián)成的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 (polyacryl ami de ge l electrop

4、horesis，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱PAGE)8反應(yīng)過(guò)程：反應(yīng)過(guò)程： TEMED催化催化AP生成硫酸自由基生成硫酸自由基 S2O82 2SO4 硫酸自由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體單體并形成單體長(zhǎng)鏈：長(zhǎng)鏈：9 Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：10PAGE法分離蛋白質(zhì)的三種效應(yīng)：法分離蛋白質(zhì)的三種效應(yīng)： 電荷效應(yīng)：電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，在同一電各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)率不同；場(chǎng)中泳動(dòng)率不同； 分子篩效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子大小和形狀各不相同，在通蛋白質(zhì)分子大小和形狀各不相同，在通過(guò)一定濃度（一定孔徑）凝膠時(shí)受阻力

5、各不相同，泳過(guò)一定濃度（一定孔徑）凝膠時(shí)受阻力各不相同，泳動(dòng)率也不相同；動(dòng)率也不相同； 濃縮效應(yīng)：濃縮效應(yīng)：凝膠為不連續(xù)系統(tǒng)（凝膠層、凝膠為不連續(xù)系統(tǒng)（凝膠層、pH、電位梯、電位梯度均不連續(xù)），從而使樣品濃縮在一個(gè)極窄的起始區(qū)度均不連續(xù)），從而使樣品濃縮在一個(gè)極窄的起始區(qū)帶，即所謂濃縮效應(yīng)，提高了條帶分辯率。（只有不帶，即所謂濃縮效應(yīng)，提高了條帶分辯率。（只有不連續(xù)凝膠具有此效應(yīng)）連續(xù)凝膠具有此效應(yīng)） 11二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 過(guò)氧化物同工酶及活性染色過(guò)氧化物同工酶及活性染色 （1 1）同工酶同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)及其

6、理化性質(zhì)不同的一組酶。同功酶是機(jī)體身的分子結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)不同的一組酶。同功酶是機(jī)體調(diào)節(jié)酶活性的一種方式，在各種生物體中廣泛存在。調(diào)節(jié)酶活性的一種方式，在各種生物體中廣泛存在。 （2 2）過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶的變化情況，可以反映某，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶的變化情況，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化

7、。一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 過(guò)氧化物同工酶及活性染色過(guò)氧化物同工酶及活性染色 （3）本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)采用PAGE技術(shù)，分離植物幼苗過(guò)氧化物酶技術(shù)，分離植物幼苗過(guò)氧化物酶同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)染色方法顯示出酶的同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶。不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶。過(guò)氧化物過(guò)氧化物+過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶 復(fù)合物復(fù)合物復(fù)合物復(fù)合物+DH2 過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶+H2O+D雙 氧 水雙 氧 水聯(lián) 苯 胺聯(lián) 苯 胺棕色物質(zhì)棕色物質(zhì)14三、儀器和試劑三、儀器和試劑1、儀器、儀器： 高速離

8、心機(jī)、垂直電泳槽、電泳儀。高速離心機(jī)、垂直電泳槽、電泳儀。2、試劑、試劑： 樣品提取液、上樣緩沖液（樣品提取液、上樣緩沖液（0.5%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)+40%蔗蔗糖）、糖）、凝膠貯液凝膠貯液N液液、分離膠緩沖液、分離膠緩沖液L液、液、10%過(guò)硫酸過(guò)硫酸銨、銨、TEMED、1電極緩沖液、電極緩沖液、同工酶顯色液同工酶顯色液。15四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 凝膠制備：凝膠制備： 聚丙烯酰胺凝膠配方聚丙烯酰胺凝膠配方成分成分含量含量作用作用N液（液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL交聯(lián)劑交聯(lián)劑L液（液（Tris） 5mL緩沖液緩沖液蒸餾水蒸餾水10mLTEMED20L加速劑加速劑4儲(chǔ)存儲(chǔ)存，用，用

9、量可量可適量調(diào)整適量調(diào)整10% AP 100L催化劑催化劑現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配，用量，用量可適量調(diào)整可適量調(diào)整16四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 樣品制備：樣品制備： 稱取稱取0.5g植物幼苗，放入研缽內(nèi)，加入植物幼苗，放入研缽內(nèi)，加入1mL樣品提取液（樣品提取液（pH8.0），于冰浴中研成勻），于冰浴中研成勻漿，全部轉(zhuǎn)入漿，全部轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，離心管中，10000r/min離離心心10min，吸取，吸取100L上清液至新離心管中，上清液至新離心管中，加入等量的上樣緩沖液，混勻，即為樣品液。加入等量的上樣緩沖液，混勻，即為樣品液。17四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 裝槽、上樣：裝槽、上樣：30L30L

10、左右左右18四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 電泳：電泳： 接好電源線（上槽接負(fù)極，下槽接正極）接好電源線（上槽接負(fù)極，下槽接正極）。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓，以。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓，以10V/cm穩(wěn)定電穩(wěn)定電壓電泳，待前沿指示染料溴酚藍(lán)下行至距膠板壓電泳，待前沿指示染料溴酚藍(lán)下行至距膠板末端末端1-2 cm處，即可停止電泳。處，即可停止電泳。19四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 剝膠、染色：剝膠、染色： 電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下，小心地將兩塊玻璃板分開，并小心地將凝膠，小心地將兩塊玻璃板分開，并小心地將凝膠置于染色盒中，進(jìn)行染色反應(yīng)，染色時(shí)間為置于染色盒中，進(jìn)行染色反應(yīng)，染色時(shí)間為10min左右，用水漂洗左右，用水漂洗1-2次即可。次即可。20五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1 12 23 34 4需要說(shuō)明：需要說(shuō)明：1、同工酶的數(shù)量。、同工酶的數(shù)量。2、同工酶的分子量大小。、同工酶的分子量大小。3、同工酶的含量大小。、同工