實驗二蛋白質等電點及含量測定ppt課件

1、1實驗二實驗二 蛋白質等電點及含量測定蛋白質等電點及含量測定n1臺可見光分光光度計配套臺可見光分光光度計配套4個玻璃比色杯，用完個玻璃比色杯，用完務必立刻洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布務必立刻洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布(紙紙)擦拭。擦拭。n實驗終了后，務必將運用過的玻璃器皿洗凈、晾實驗終了后，務必將運用過的玻璃器皿洗凈、晾干、放回原處。干、放回原處。P40/P512n學習蛋白質的兩性解離性質，掌握學習蛋白質的兩性解離性質，掌握pH值法測定蛋值法測定蛋白質等電點的普通原理和操作方法。白質等電點的普通原理和操作方法。n學習和掌握雙縮脲法測定蛋白質濃度的原理和操學習和掌握雙縮脲法測定蛋白質濃

2、度的原理和操作方法。作方法。蛋白質等電點的測定蛋白質等電點的測定4n蛋白質是兩性電解質，在溶液中存在如下平衡：蛋白質是兩性電解質，在溶液中存在如下平衡：5n蛋白質分子所帶凈電荷為零時的蛋白質分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質的等值稱為蛋白質的等電點電點pI。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極挪動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉任何一極挪動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向添加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、浸的傾向添加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、浸透壓均減到最低，且溶液變混濁。透壓均減到最低，且溶液變混濁。n牛乳中的酪蛋白的等電點

3、是牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7-4.8。本實驗采用蛋白質。本實驗采用蛋白質在不同在不同pH溶液中構成的混濁度來確定，即混濁度最大溶液中構成的混濁度來確定，即混濁度最大時的時的pH值即為該種蛋白質的等電點值。值即為該種蛋白質的等電點值。6n 實驗儀器實驗儀器n 4支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL、槍頭、槍頭200uL等。等。n 實驗資料和試劑實驗資料和試劑n 蒸餾水、蒸餾水、1M醋酸、醋酸、0.1M醋酸、醋酸、0.01M醋酸、酪蛋醋酸、酪蛋白溶液。白溶液。7n每小組取每小組取4支支15mL玻璃試管，按下表順序分別準確地玻璃試管，按下表順序分

4、別準確地參與各試劑，參與后立刻混勻，加一管，搖勻一管。參與各試劑，參與后立刻混勻，加一管，搖勻一管。管號管號H2O/mL0.01M HAC/mL0.1MHAC/mL1M HAC/mLpH酪蛋白溶酪蛋白溶液液/mL察看景象察看景象min0 10 20 18.400.6-5.91 28.7-0.3-5.31 38.00-1.00-4.71 47.40-1.603.51 n靜置，察看各管在不同時間的混濁度。最混濁的一管靜置，察看各管在不同時間的混濁度。最混濁的一管pH即為即為酪蛋白的等電點。察看時可用酪蛋白的等電點。察看時可用+，+，+，表示渾濁度。，表示渾濁度。8n察看各管中清澈度變化，記錄結果察

5、看各管中清澈度變化，記錄結果 用用+，+，+，表示渾濁度并解釋景象。表示渾濁度并解釋景象。n確定酪蛋白的等電點。確定酪蛋白的等電點。n蛋白質在等電點沉淀的緣由是什么？影響該實蛋白質在等電點沉淀的緣由是什么？影響該實驗結果準確性的要素有哪些？驗結果準確性的要素有哪些？蛋白質含量的測定蛋白質含量的測定雙縮脲法測定蛋白質含量11n雙縮脲雙縮脲NH3CONHCONH3是兩分子尿素經是兩分子尿素經180左右加熱，放出左右加熱，放出1個分子氨后得到的產物。個分子氨后得到的產物。n在強堿性溶液中，雙縮脲能與在強堿性溶液中，雙縮脲能與Cu 構成紫紅色絡構成紫紅色絡合物，稱為雙縮脲反響。合物，稱為雙縮脲反響。n

6、凡具有兩個酰胺基或兩個直接銜接的肽鍵，或能凡具有兩個酰胺基或兩個直接銜接的肽鍵，或能過過1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反響。蛋白質含有多個肽鍵，可發(fā)生雙縮雙縮脲反響。蛋白質含有多個肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反響。脲反響。2+12n紫紅色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，紫紅色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，顏色深淺而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，顏色深淺可在可在540 nm比色測定，故可用此法來測定蛋白質比色測定，故可用此法來測定蛋白質含量。測定的蛋白質濃度范圍為含量。測定的蛋白質濃度范圍為1-10 mg/

7、mL。n此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要缺陷是靈敏度深淺相近，以及干擾物質少。主要缺陷是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需求快速，但并不需求差。因此雙縮脲法常用于需求快速，但并不需求非常準確的蛋白質測定。非常準確的蛋白質測定。13n 實驗儀器實驗儀器n 6支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL、槍頭槍頭200uL、可見光分光光度計等。繪制規(guī)范曲線、可見光分光光度計等。繪制規(guī)范曲線n 2支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL

8、、槍頭槍頭200uL、可見光分光光度計等。樣品測定、可見光分光光度計等。樣品測定n 實驗資料和試劑實驗資料和試劑n 雙縮脲試劑、規(guī)范牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品可以雙縮脲試劑、規(guī)范牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。14n1.規(guī)范曲線的繪制。全班繪制規(guī)范曲線的繪制。全班繪制1份即可份即可n取取6支支15mL試管，編號試管，編號0-5，按下表順序參與各試劑。，按下表順序參與各試劑。試劑試劑/mL/mL試管試管0 01 12 23 34 45 5規(guī)范牛血潔白規(guī)范牛血潔白蛋白蛋白0.00.00.40.40.80.81.21.

9、21.61.62.02.0蒸餾水蒸餾水2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40.00.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質含量蛋白質含量 mg/mLmg/mL0.00.02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.015 上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置30 min。 以以0號管為對看管，于號管為對看管，于540 nm處比色測定吸光值，記處比色測定吸光值，記下各管吸光度。下各管吸光度。 以每管蛋白質含量為橫坐標，對應吸光度為縱坐標，以每管蛋白質含量為橫坐標

10、，對應吸光度為縱坐標，作吸光度作吸光度-蛋白質含量規(guī)范曲線。見電腦桌面蛋白質含量規(guī)范曲線。見電腦桌面Excel表格表格“規(guī)范曲線繪制規(guī)范曲線繪制16n2.蛋白質樣品測定蛋白質樣品測定 每小組做每小組做1份份n 1.另取另取2支試管，分別加支試管，分別加1 mL未知濃度的酪蛋白蛋白未知濃度的酪蛋白蛋白質樣品液留意樣品濃度不要超越質樣品液留意樣品濃度不要超越10 mg/mL，加，加1 mL蒸餾水，加蒸餾水，加4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30 min。n 2.2支樣品溶液于支樣品溶液于540nm處比色測定吸光值。處比色測定吸光值。n 3. 取兩組樣品測定的吸光值平均值

11、，根據回歸方程計取兩組樣品測定的吸光值平均值，根據回歸方程計算出相應蛋白質的算出相應蛋白質的 濃度。濃度。n 4.按以下公式計算出樣品蛋白質的含量：按以下公式計算出樣品蛋白質的含量：樣品蛋白質含量樣品蛋白質含量mg/100 mL=YN100/V 式中，式中，Y為規(guī)范曲線查得的蛋白質的量為規(guī)范曲線查得的蛋白質的量mg，N為稀釋倍數，為稀釋倍數，V為樣品所取的體積為樣品所取的體積mL。y = 0.042x - 0.000417樣品蛋白質含量樣品蛋白質含量mg/100 mL=YN100/V2.計算樣品蛋白質的含量計算樣品蛋白質的含量 式中，式中，Y為規(guī)范曲線查得的蛋白質的量為規(guī)范曲線查得的蛋白質的量mg，N為稀釋為稀釋倍數，倍數，V為樣品所取的體積為樣品所取的體積mL。1.繪制蛋白質規(guī)范曲線繪制蛋白質規(guī)范曲線18n影響規(guī)范曲線的要素有哪些？影響規(guī)范曲線的要素有哪些？n蛋白質含量測定中需求留意什么問題？蛋白質含量測定中需求留意什么問題？19n等電點測定的實驗要求各種試劑的濃度和參與量必等電點測定的實驗要求各種試劑的濃度和參與量必需非常準確。需非常準確。n規(guī)范曲線選擇不能只看規(guī)范曲線選擇不能只看R ，還應該看曲線斜率和截，還應該看曲線斜率和截距。距。R 大小與實驗操作和儀器都有關系。大小與實驗操作和儀器都有關系。 n顯色時間過長，能夠會出現霧狀沉淀，影響比色。顯色時間過長