依利特液相提綱

1、液相色譜實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握儀器原理、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用及儀器使用注意事項(xiàng)。掌握色譜工作站的使用，獨(dú)立操作，建立分析方法，了解色譜條件優(yōu)化方法，建立單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析待測(cè)樣品濃度?；驹恚荷V儀是用來(lái)分析分離混合物的儀器，它是利用混合物各組分在固定相和流動(dòng)相上的分配系數(shù)不同，對(duì)物質(zhì)的組分進(jìn)行分離，定性定量分析。液相色譜主要用于高沸點(diǎn)、遇熱易分解以及具有生物活性的組分的分析分離。本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)針對(duì)依利特液相色譜的紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、單泵、手動(dòng)進(jìn)樣器及比較常用的化學(xué)鍵合固定相C18柱（反相柱）的原理、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用及儀器使用注意事項(xiàng)進(jìn)行基本操作訓(xùn)練，掌握用外標(biāo)法單點(diǎn)定量的要點(diǎn)及注意事項(xiàng)，掌握色譜工作站的設(shè)置

2、、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、打印數(shù)據(jù)譜圖報(bào)告的方法。化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合相色譜法是由液液分配色譜法發(fā)展而來(lái)。分配色譜法雖然分離效果好，但由于固定液的流失，會(huì)使柱效和分離選擇性下降。流失的固定相會(huì)使基線的噪聲增加，降低了檢測(cè)器的靈敏度?；瘜W(xué)鍵合相色譜法已逐漸取代液液分配色譜法，廣泛應(yīng)用，在高效液相色譜法中占有極其重要的地位。根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相的相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可分為正相鍵合相色譜和反相鍵合相色譜。反相鍵合相色譜的鍵合固定相極性小于流動(dòng)相的極性，適合分離非極性、極性和離子型化合物。應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜更為廣泛，約70%-80%的分析任務(wù)皆由反相鍵合相色譜法完成。非極性烷基鍵合相是目前最廣泛應(yīng)用

3、的柱填料，尤其是十八烷基硅烷鍵合相(Octadecylsilyl,簡(jiǎn)稱 ODS-C18) 在反相液相色譜中發(fā)揮著重要作用，它可完成高效液相色譜分析的大部分任務(wù)。化學(xué)鍵合固定相是將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上,是目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；主要有 a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： SiCd. 硅氮鍵型： SiN化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （3）選

4、擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)，高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反；影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u流速對(duì)分離效果的影響：流速對(duì)柱效的影響如圖所示。在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)

5、整分離度和保留時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。分離類型選擇儀器使用注意事項(xiàng)流動(dòng)相：配制

6、前需要分別用0.45m有機(jī)相膜和水膜過(guò)濾，避免塵埃阻塞色譜柱，使用前需要超聲波脫氣或使用在線脫氣機(jī)脫氣（最好的脫氣方法是用氦氣，但價(jià)格昂貴，一般不用）。恒流泵：使用前先要打開排氣閥，排除流動(dòng)相管線中的氣體，一定不要讓氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。檢測(cè)器：可在200-400nm之間調(diào)節(jié)，選定最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)得到色譜圖。色譜柱：一定要了解色譜柱的性能，不要把不適合做的樣品進(jìn)到色譜柱中，會(huì)使色譜柱廢掉。如果使用加入了緩沖溶液的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一定要用85%的甲醇水洗柱子20-30分鐘，否則鹽分會(huì)在柱子中結(jié)晶，占據(jù)固定相的空間，以后再用其它流動(dòng)相時(shí)，鹽會(huì)溶解，柱子的死體積增加，柱效下降，分離效果差。長(zhǎng)期

7、不使用時(shí)要用100%的甲醇洗30分鐘以上。樣品濃度不要太大。對(duì)于復(fù)雜樣品可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比或加酸、加堿、加緩沖溶液改變流動(dòng)相的PH值。我們用的ODS-C18（反相色譜柱）可在PH值3-8之間。手動(dòng)進(jìn)樣裝置：必須使用平頭進(jìn)樣器，否則會(huì)損壞六通進(jìn)樣閥。樣品配制后需要用0.45m有機(jī)相膜或水膜過(guò)濾，進(jìn)樣前需用樣品潤(rùn)洗進(jìn)樣器5-7次，取樣品量是進(jìn)樣量的兩倍以上，針尖向上排出氣泡，準(zhǔn)確留出進(jìn)樣體積，分析易揮發(fā)組分，需在進(jìn)樣前隨進(jìn)隨取，避免樣品或溶劑揮發(fā)，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。為了確保進(jìn)樣量準(zhǔn)確，可以使用一定體積的定量管（定量環(huán)），但進(jìn)樣量要大，保證把定量管里的體積全部置換。思考題1. 簡(jiǎn)述液相色譜分析與氣相色譜分析的異同點(diǎn)？2. 影響標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的原因？3. 液相色譜中改變流速對(duì)分離、峰面積、峰形有何