丹參注射液預(yù)防深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、丹參注射液預(yù)防深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究(一)    【摘要】 目的探討丹參預(yù)防深靜脈血栓形成的作用。方法24只日本大耳白兔按隨機(jī)原則分為3組（每組8只）：正常組、模型組及丹參預(yù)防組，按股靜脈結(jié)扎法制作模型，作相關(guān)血液流變學(xué)指標(biāo)、血清SOD活性及MDA含量檢測并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察血管內(nèi)皮形態(tài)的變化。結(jié)果丹參預(yù)防組能明顯地改善血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，提高血清SOD活性、降低血清MDA含量（P0.05），預(yù)防組內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度明顯輕于模型組。結(jié)論丹參注射液能有效預(yù)防深靜脈血栓形成，這可能是其通過抗氧化作用保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮作用。 【關(guān)鍵詞】 丹參；深靜脈血栓形

2、成； 內(nèi)皮細(xì)胞；預(yù)防作用Abstract:ObjectiveTo study the preventive effect of Salvia miltiorrhiza on deep venous thrombosis(DVT).Methods24 rabbits were randomly divided into 3 groups(n=8):normal group,model group and Salvia Miltiorrhiza-prevented group.Rabbit model of DVT was made by ligating the femoral vein.The

3、 related rheology indices , activity of SOD and content of MDA in rabbits blood serum were measured and statistically analyzed,and endothelium form of blood vessel was observed.ResultsSalvia Miltiorrhiza-prevented group obviously improve the rheology indices, increase the activity of SOD and decreas

4、e the content of MDA in rabbit blood serum (P0.05), the injury of endothelial cell in the prevented group were lighter than that in the model group.ConclusionSalvia miltiorrhiza has favorable effect on DVT,and the mechanison may be related to protect the injury of endothelial cell through antioxidat

5、ive action.Key words:Salvia miltiorrhiza; Deep venous thrombosis(DVT); Endothelial cell; Preventive effect深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈腔內(nèi)不正常地凝結(jié)，阻塞靜脈管腔，導(dǎo)致靜脈回流阻礙，全身主干靜脈均可發(fā)病，尤其多見于下肢，是骨科術(shù)后常見的靜脈性疾病。其起病較急，若不及時(shí)治療容易導(dǎo)致血栓形成加重，嚴(yán)重者可引起肢體壞死1。臨床上90%的肺栓塞是由下肢深靜脈血栓引起的2，故探討其發(fā)病危險(xiǎn)因素及預(yù)防有重要意義。目前預(yù)防深靜脈血栓形成的藥物主

6、要是抗凝血藥和抗血小板聚集藥,但其能引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥如出血、血腫等。尋找一種安全、有效、副作用小的預(yù)防深靜脈血栓形成的有效途徑成為重要的研究課題。我們基于中醫(yī)藥活血化淤的理論采用丹參注射液進(jìn)行了預(yù)防深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究，旨在為預(yù)防深靜脈血栓形成提供一種新的思路。1 材料與方法1.1 材料健康成年日本大耳白兔24只，雌雄各半，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，體重（2.0±0.2）kg。丹參注射液（國藥準(zhǔn)字Z51021303，每毫升含生藥1.5 g）。血流變儀（北京 賽科希德SA-6000）；血凝儀（美國 貝克曼-庫爾特ACL-9000）。BMJ-型病理組織包埋冷凍臺；LEICA

7、RM 2235型切片機(jī)、圖文分析系統(tǒng)；CS-型攤片烤片機(jī)。超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。恒溫水浴箱，可見光分光光度計(jì)。1.2 方法24只日本大耳白兔常溫適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，雌雄分籠，按隨機(jī)原則分為3組，每組8只：正常組，不做特殊處理；模型組，造模前1周起每天耳緣靜脈注射2 ml生理鹽水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；丹參預(yù)防組，造模前1周起2g/(kg·d)丹參注射液耳緣靜脈注射，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。參考王輝等3的下肢深靜脈模型制備方法，模型組與預(yù)防組用藥1周后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射，麻醉滿意后常規(guī)備皮、固定，沿股靜脈走向切開皮膚,玻璃分

8、針鈍性分離皮下組織及肌肉，充分暴露，游離其雙側(cè)股靜脈長約4 cm，4絲線分別結(jié)扎其遠(yuǎn)近段，縫合傷口，造模后肌內(nèi)注射慶大霉素0.5 ml/d預(yù)防感染。1.3 檢測指標(biāo) 正常組在適應(yīng)性喂養(yǎng)后即采空腹靜脈血1.8，5 ml迅速置于枸櫞酸鈉及肝素抗凝管中檢測凝血功能、全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等指標(biāo)，模型組與預(yù)防組在用藥1周后于造模前采空腹靜脈血1.8 ml迅速置于枸櫞酸鈉抗凝管中檢測凝血功能，并在造模成功后觀察動(dòng)物的下肢腫脹、傷口及呼吸情況，在第3，7 天再次分別取空腹靜脈血2，1.8，5 ml迅速置于普通管、枸櫞酸鈉及肝素抗凝管中檢測血清SOD活性及MDA含量；測凝血功能、全血黏度、血漿黏

9、度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等指標(biāo)。造模后第7天空氣栓塞法處死動(dòng)物，將所結(jié)扎靜脈段取出迅速放入10%甲醛溶液中固定,采用常規(guī)石蠟切片制作法包埋,石蠟切片機(jī)切片，常規(guī)HE染色，在10×，40×光鏡下觀察并攝片。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用±s表示，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。2 結(jié)果2.1 大體觀察模型組與預(yù)防組動(dòng)物造模成功后,雙下肢均出現(xiàn)不同程度的彌散性腫脹，但用藥組造模后其腫脹程度明顯低于模型組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)切口均未感染，在實(shí)驗(yàn)過程中均未發(fā)現(xiàn)呼吸困難、呼吸急促的肺梗塞癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死并解剖動(dòng)物時(shí)也未發(fā)現(xiàn)全身諸組織器官出血。2.2 造模前凝血功能的檢

10、測丹參預(yù)防組用藥1周后凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)與正常組相比較P>0.05，說明預(yù)防性用藥的安全性。見表1。表1 造模前預(yù)防組與正常組凝血功能比較(略)2.3 造模后第3天血液流變學(xué)及凝血功能指標(biāo)的檢測模型組造模后第3天各血液流變學(xué)指標(biāo)與正常組相比P0.05，提示血液處于“高凝”狀態(tài)，與深靜脈血栓形成臨床指征相符，預(yù)防組各血液流變學(xué)指標(biāo)與模型組相比P0.05，與正常組相比較P>0.05（見表2）；同時(shí)在凝血功能方面，預(yù)防組、模型組與正常組相比各指標(biāo)均未見明顯差異。見表3。表2 造模后第3天各組血流變學(xué)指標(biāo)比較(略)表3 造模后第3天各組凝血功能比較(略)2.4 造模后第7天血液流變學(xué)及凝血功

11、能指標(biāo)的檢測預(yù)防組與模型組在造模后第7天各血液流變學(xué)指標(biāo)與模型組相比有顯著性差異；在凝血功能方面，預(yù)防組、模型組與正常組相比較P>0.05（見表45）。表4 造模后第7天預(yù)防組與模型組血流變學(xué)指標(biāo)比較(略)表5 造模后第7天預(yù)防組與模型組凝血功能比較(略)2.5 造模后第3天，第7天各組血清SOD活性及MDA含量比較預(yù)防組與模型組在造模后第3天，第7天血清SOD活性及MDA含量相比P0.05（見表67）。表6 造模后第3天各組血清SOD活性及MDA含量比較(略)表7 造模后第7天各組血清SOD活性及MDA含量比較(略)2.6 病理組織學(xué)觀察正常組靜脈管壁連續(xù)，血管內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞無脫落

12、，管腔內(nèi)有散在的血細(xì)胞成分（見圖12）；造模后第7天，模型組靜脈管壁的連續(xù)性中斷，血管內(nèi)膜不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞大部分脫落，可見大量血栓形成，以混合血栓及紅色血栓為主，且血栓充滿管腔，并附著于管壁上（見圖34）；預(yù)防組靜脈管壁的連續(xù)性較完整，血管內(nèi)膜規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，管腔內(nèi)可見少量血栓形成，部分與管壁附著（見圖56）。3 討論本病屬中醫(yī)學(xué)“腫脹”“淤證”“血瘤”“筋瘤”“惡脈”“淤血流注”“脈痹”等范疇，1994年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)將該病明確命名為“股腫”4。1946年，Virchow提出：靜脈壁損傷、血流緩慢和血液高凝狀態(tài)是造成深靜脈血栓形成的三大因素，至今仍被沿用5

13、，骨科手術(shù)涉及創(chuàng)傷、應(yīng)激、制動(dòng)、長期臥床等多種因素，與Virchow學(xué)說的三大因素密切相關(guān)。臨床上常用抗栓藥物以預(yù)防血栓形成或溶解血栓，但是這些藥物應(yīng)用過量便會造成出血，用量不足則達(dá)不到預(yù)期療效，因此在應(yīng)用這些藥物的過程中必須作實(shí)驗(yàn)室檢測，丹參預(yù)防組在預(yù)防性用藥1周、造模后第3天及第7天后凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)與正常組相比較P>0.05，說明用藥的安全性。活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）是目前推薦應(yīng)用的內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選實(shí)驗(yàn)，而血漿凝血酶原時(shí)間（PT）是反映外源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選實(shí)驗(yàn)6，丹參預(yù)防組在預(yù)防性用藥1周、造模后第3天PT與正常組比較P0.0

14、5。這一方面是應(yīng)用抗凝藥物的表現(xiàn)，另一方面提示丹參可能正是作用于外源性凝血系統(tǒng)，同時(shí)在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)預(yù)防組活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、血漿凝血酶原時(shí)間（PT）及凝血酶時(shí)間（APTT）較正常組均有不同程度的延長，這本身也就說明了丹參注射液預(yù)防深靜脈血栓形成的有效性。在血液流變學(xué)方面，模型組造模后第3天各血液流變學(xué)指標(biāo)與正常組相比P0.05，說明該造模方法有效、可行，預(yù)防組與模型組在造模后第3天及第7天各血液流變學(xué)指標(biāo)與模型組相比有顯著性差異，提示丹參注射液確有預(yù)防深靜脈血栓形成的功效。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，此

15、酶能清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，丙二醛（malondialdehyde，MDA）是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，對MDA的檢測可反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度，在造模后第3天及第7天預(yù)防組血清SOD活性及MDA含量與模型組比較P0.05，這說明丹參能有效減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及提高機(jī)體抗氧化能力。內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, EC)是位于循環(huán)系統(tǒng)血管壁內(nèi)皮下組織之間的一層單層細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能正常在調(diào)節(jié)凝血、抗凝和纖溶過程中具有重要作用，主要

16、表現(xiàn)在：血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放舒血管物質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子(endothelial derived relaxing factor,EDRF)和前列環(huán)素(prostacylin,PGI2)，兩者不僅具有舒血管作用，還可抑制血小板聚集，因而有較強(qiáng)的抗血栓形成作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上有ADP酶能水解ADP，而ADP是引起血小板聚集的誘導(dǎo)物。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面表達(dá)肝素樣物質(zhì)（硫酸乙酰肝素等），并與抗凝血酶(AT-)結(jié)合產(chǎn)生抗凝作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面可表達(dá)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM），凝血酶與TM形成復(fù)合物后對蛋白質(zhì)C的活化效率大大提高。內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生或促進(jìn)組織型纖溶酶原活化素(t-PA )、尿激酶纖溶酶原

17、活化素(u-PA )等纖溶酶原激活物，促進(jìn)纖溶過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞是組織因子途徑抑制物(TFPI)合成的主要場所。血管內(nèi)皮細(xì)胞還可攝取與破壞血小板聚集的活性物質(zhì)，如5羥色胺(5-HT) 7，8。早期靜脈血栓形成后，局部低氧環(huán)境使內(nèi)皮細(xì)胞變性、壞死，部分脫落于血液中而形成循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞9。本實(shí)驗(yàn)通過靜脈病理組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組在造模后第7天靜脈管壁的連續(xù)性中斷，血管內(nèi)膜不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞大部分脫落；預(yù)防組靜脈管壁的連續(xù)性較完整，血管內(nèi)膜規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞少量脫落。以上結(jié)果表明，預(yù)防組的內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度輕于模型組，提示丹參具有保護(hù)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其損傷的功能，對預(yù)防深靜脈血栓形成具有重要意義。丹參是

18、我國傳統(tǒng)中藥中的代表藥，有良好的活血化淤功效。本實(shí)驗(yàn)以丹參注射液為干預(yù)因素研究其預(yù)防深靜脈血栓形成的作用。預(yù)防組用藥后,有效且安全地降低了血黏度，同時(shí)血清SOD活性升高、MDA含量降低，提示丹參能減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及提高機(jī)體抗氧化能力,并減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，因而可以推測,丹參可能正是通過提高機(jī)體抗氧化能力減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，從而起到預(yù)防深靜脈血栓形成的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Arcaso S M,VachaniA.Local and systemic thrombolytic therapy for acute venous thromboembolismJ.Clin Chest M