抑制型電導(dǎo)和脈沖積分安培檢測(cè)-離子色譜法測(cè)定

1、抑制型電導(dǎo)和脈沖積分安培檢測(cè)-離子色譜法測(cè)定摘要：本文采用IonPac CS18，一種弱酸型陽離子交換柱，與抑制型電導(dǎo)檢測(cè)、積分脈沖安培檢測(cè)（IPAD）和紫外檢測(cè)(UV)聯(lián)用無需衍生測(cè)定肉和奶酪中的生物胺。CS18柱無需使用高濃度酸淋洗液和有機(jī)溶劑就可以分離生物胺，且同樣可以保證洗脫相近峰如腐胺和尸胺的分離 關(guān)鍵詞： 生物胺； 弱酸型陽離子交換柱；抑制型電導(dǎo)檢測(cè)；積分脈沖安培檢測(cè)（IPAD）；紫外檢測(cè)(UV) 生物胺在人類和動(dòng)物生理學(xué)功能上扮演著非常重要的角色，與食品腐敗和安全直接相關(guān)。從常規(guī)飲食中攝入低量生物胺并不危險(xiǎn)，但是若攝入量過高則會(huì)引起低血壓（組胺、腐胺和尸胺）、高血壓（酪胺）、偏頭

2、痛（酪胺和苯乙胺）、惡心、皮疹、暈眩、心輸出量增加，以及呼吸加速。食品在被食用前為了評(píng)估其潛在的健康隱患而進(jìn)行生物胺的測(cè)定顯得至關(guān)重要。 生物胺通常采用反相HPLC，UV或者熒光檢測(cè)。由于絕大多數(shù)生物胺缺少合適的發(fā)光和熒光基團(tuán)，所以需要進(jìn)行柱前或柱后衍生后才能檢測(cè)。最常用的衍生試劑包括丹磺酰氯、苯酰氯和o-苯二醛（OPA）。這些衍生步驟在耗費(fèi)時(shí)間、人力的同時(shí)還導(dǎo)致了潛在的副產(chǎn)物干擾，使得胺的測(cè)得量或高或低。 本文采用IonPac CS18，一種弱酸型陽離子交換柱，與抑制型電導(dǎo)檢測(cè)、積分脈沖安培檢測(cè)（IPAD）和紫外檢測(cè)(UV)聯(lián)用無需衍生測(cè)定肉和奶酪中的生物胺。CS18柱無需使用高濃度酸淋洗液

3、和有機(jī)溶劑就可以分離生物胺，且同樣可以保證洗脫相近峰如腐胺和尸胺的分離。溫和的分離條件使得抑制型電導(dǎo)也可以檢測(cè)許多未經(jīng)衍生的生物胺。IPAD對(duì)抑制后缺少一個(gè)電荷的生物胺同樣可以檢測(cè)，此法已經(jīng)應(yīng)用于巧克力中生物胺的測(cè)定。UV則可用來確認(rèn)與其它胺或氨基酸共淋洗的弱保留芳香生物胺的存在和濃度。 1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器與試劑 Dionex ICS-3000 系統(tǒng)；Chromeleon 6.7 色譜控制軟件；攪拌器（家庭和工業(yè)強(qiáng)度型）；離心機(jī)（Beckman Coulter，Brea，CA）；渦流混合器（Fisher Scientific） 去離子水，I級(jí)純，電阻率大于等于18Mcm； 氫氧化鈉，5

4、0%（w/w）(Fisher Scientific，SS254-1)； 甲烷磺酸，99%（Dionex公司，P/N 033478） 1.2色譜條件 柱：IonPac CS18 Analytical，2250 mm (P/N 062878)；IonPac CG18 Guard,250 mm(P/N 062880)； 淋洗液*：06 min, 3 mM MSA；610 min，310 mM；1022 min, 1015 mM；2228 min, 15 mM；2835 min,1530 mM；35.145 min，3045 mM。 淋洗液源：EG淋洗液發(fā)生器單元； 流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣

5、體積：5 L；溫度：40（下溫控室），30（上溫控室）； 檢測(cè)方式：* 抑制型電導(dǎo)， CSRS ULTRA (2 mm),外接水自抑制模式，電流設(shè)定為40mA，UV-Vis檢測(cè)設(shè)置為276 nm；背景電導(dǎo): 0.40.5 S； 電導(dǎo)噪音: 0.20.3 nS； 系統(tǒng)反壓: 2500 psi 柱后加入法： 檢測(cè)方式：積分脈沖安培法（IPAD），常規(guī)Au電極； 柱后試劑流速：100 mM NaOH，0.24 mL/min； IPAD背景：4050 nC； IPAD噪音：6070 pC (沒裝抑制器)，210 pC (裝抑制器) 在進(jìn)樣前需先用3 mM MSA平衡柱子5min； 本注解中介紹了三種不

6、同的檢測(cè)配置：IPAD,抑制型電導(dǎo)-IPAD和UV-IPAD 1.3樣品前處理 取5 g基本樣品到50 mL離心管中，并隨后加入20 mL 100 mM MSA提取。使用渦流混合器混勻該混合物1 min，在轉(zhuǎn)速6000 rpm 和4條件下離心20 min。傾出上清液，用0.2 m濾頭過濾到50 mL容量瓶中。往離心管中再次加入20 mL MSA，重復(fù)進(jìn)行萃取。上清液過濾到容量瓶中，并用去離子水稀釋到刻度。在分析之前，提取液需要與去離子水1：1稀釋。 獼猴桃和巧克力（70%可可） 獼猴桃和巧克力樣品也是取5 g基本樣品到50 mL離心管中，并隨后加入10 mL 100 mM MSA提取。樣品提取

7、如同菠菜中所提及，但是無需在測(cè)定前進(jìn)行稀釋。 黑巧克力和牛奶巧克力 取2 g基本樣品到15 mL離心管中，并隨后加入4 mL 100 mM MSA提取。使用渦流混合器混勻該混合物1 min，在轉(zhuǎn)速6000 rpm 和4條件下離心30 min。傾出上清液，用0.2 m濾頭分別過濾到容量瓶中，用離子水1：1稀釋。 2結(jié)果和討論 圖1 生物胺的分離和檢測(cè)(A. 抑制型電導(dǎo)，B. IPAD，C. 色胺使用UV檢測(cè))圖1為生物胺的分離情況，以抑制型電導(dǎo)、積分脈沖安培和UV檢測(cè)（為串接）。多巴胺、酪胺和色胺不能通過抑制型電導(dǎo)檢測(cè)，因?yàn)樗麄冊(cè)诒灰种坪笕鄙僬姾?。因此，要檢測(cè)10種生物胺就需要配合IPAD使用

8、。色胺的存在與否之前使用IPAD確定，而UV檢測(cè)同樣也可以驗(yàn)證其存在。 使用電解產(chǎn)生的MSA淋洗液可以簡化方法，使得開發(fā)出分離目標(biāo)生物胺最佳梯度的過程更加容易。電解產(chǎn)生淋洗液在之前的研究中還沒有同IPAD一起使用過，因?yàn)镸SA淋洗液產(chǎn)生過程中產(chǎn)生氧氣。淋洗液中的溶解氧會(huì)對(duì)背景信號(hào)產(chǎn)生很大的變化，因此必須被脫除。通過使淋洗液通過EG脫氣裝置的淋洗液通道、而外接水則通過其Regen通道從而脫除掉氧氣。由于背景不再出現(xiàn)反復(fù)無常的變化，說明EG產(chǎn)生的氧氣已經(jīng)被脫除。EG只需要添加去離子水而簡化了方法開發(fā)，避免了手工離線配制淋洗液時(shí)產(chǎn)生的潛在錯(cuò)誤和不一致。 圖2 含有70%可可的巧克力生物胺IPAD測(cè)定

9、(A)未加標(biāo)樣品（B）加標(biāo)樣品濃度是按照稀釋倍數(shù)1：22計(jì)算 菠菜葉中的生物胺濃度在4冰箱中貯藏3周后發(fā)生了很大的變化。亞精胺濃度從48.5降低到3.3 mg/kg，而組胺和精胺則完全降解（圖3），61 mg/kg組胺的完全降解是一個(gè)很有意思的結(jié)果。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣品只用IPAD進(jìn)行重新測(cè)定，此法可以用于確認(rèn)組胺的不存在。早期的研究結(jié)果標(biāo)明在蔬菜產(chǎn)品在冰箱中保存三周后腐胺、亞精胺和精胺的濃度發(fā)生了改變。盡管Leuschner等證明某些微生物能夠降解組胺，但是找不到任何相關(guān)蔬菜中組胺降解的數(shù)據(jù)。獼猴桃在4貯藏2周后，組胺大約降低了82%，亞精胺增加了25%，而精胺濃度則沒有改變。貯藏之后獼猴桃中的組胺完全被降解。 圖3 菠菜中生物胺分離和檢測(cè)（A）IPAD(新鮮樣品)和（B）抑制型電導(dǎo)（4下貯藏三周） 3 結(jié)論 多聚弱酸陽離子交換柱IonPac CS18可以用于分離各種食品樣品中的生物胺，檢測(cè)方式可以為IPAD、抑制型電導(dǎo)和UV。本方法使用簡單的電化學(xué)產(chǎn)生的MSA淋洗液而無需使用溶劑和以前報(bào)道的腐蝕性淋洗系統(tǒng)。此外，本法適用于很多種樣品基體，并具有很好的精確