人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT試劑盒使用方法

1、人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒使用方法檢測范圍：96T2 U/L -60U/L使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。用純化的人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，再與HRP標(biāo)記的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原- 酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT

2、)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度(0D值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人丙氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶(ALT)濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml X 1 瓶7終止液6ml X 1 瓶2酶標(biāo)試劑6ml X 1 瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(120U/L )0.5ml X 1 瓶3酶標(biāo)包被板12孔X 8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X 1 瓶4樣品稀釋液6ml X 1 瓶10說明書1份5顯色劑A液6ml X 1 瓶11圭寸板膜2張6顯色劑B液6ml X 1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20 C保存，但應(yīng)

3、避免反復(fù)凍融2.不能檢測含 NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。60U/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液30U/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液15U/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液7.5U/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液3.75U/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150 d的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150 d標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)

4、、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50山,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40山,然后再加待測樣品10 d (樣品最終稀釋度為 5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育用封板膜封板后置37 C溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50 ，空白孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50 ，再加入顯色劑 B50 ，輕輕震蕩混勻，37 C避光顯色15分鐘.10.終止每孔加終止液

5、50 J，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測定以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）。測疋應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37C反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37匸反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入顯色液爪B, 37匸顯色10分鐘4/加入終止液15分鐘之內(nèi)讀0D值計(jì)算計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即

6、為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計(jì) 算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX 5）O5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6.底物請避光保存。7嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).