右心室肥大時心肌間質(zhì)膠原改建及其前膠原基因的表達

1、    【摘要】目的了解法樂四聯(lián)癥肥大右室心肌間質(zhì)、型膠原的改建及與前膠原基因mRNA表達的關(guān)系，為防治心肌間質(zhì)膠原改建提供新的依據(jù)和途徑。方法用生化方法定量分析了22例法樂四聯(lián)癥患者和8例非心血管及膠原系統(tǒng)疾病尸檢者的右室心肌間質(zhì)中的膠原含量和、型膠原比值，以及用斑點雜交法測定法樂四聯(lián)癥患者右室心肌間質(zhì)、型前膠原基因mRNA的表達。結(jié)果法樂四聯(lián)癥組心肌間質(zhì)膠原含量為（14.85±2.48）g/mg總蛋白，較對照組(7.55±1.89) g/mg總蛋白明顯增多（P0.05）；其/型膠原比值為5.10±1.84，較對照組2.2

2、7±0.58顯著增高（P0.05）；法樂四聯(lián)癥組右室心肌間質(zhì)膠原含量與、型前膠原基因表達強度的相關(guān)系數(shù)分別為0.80（P0.001）、-0.277（P0.10）。右室心肌間質(zhì)膠原/型比值與/ 型前膠原基因表達強度比值呈正相關(guān)，r=0.47（P0.05）。結(jié)論提示法樂四聯(lián)癥肥大右室心肌間質(zhì)存在以膠原含量增多和/型比值增高為特點的膠原改建，且主要與型前膠原基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)有關(guān)。 Remodeling of myocardial interstitial collagen and procollagen gene expression 【Abstract】ObjectiveTo i

3、nvestigate the characteristics and procollagen gene expression of myocardial interstitial collagen of right ventricle in tetralogy of Fallot (TOF).MethodsSamples of the infundibular septum from 22 patients with TOF and 8 patients without cardiovascular disease and collagen system disease as control

4、were studied. Collagen was determined by biochemical methods, Pro (I) mRNA, Pro (III) mRNA levels were determined by dot blot hybridization.ResultsThe hydroxyproline concentration and the ratio of type / collagen in the right ventricle with TOF were significantly higher than those in controls 14.85&

5、#177;2.48 (±s) g/mg total protein vs 7.55±1. 89 g/mg total protein, respectively, P0.05; 5.10±1.84 vs 2.27±0.58, P0.05, respectively. The correlation between the hydroxyproline concentration with the level of Pro ()mRNA, Pro () mRNA were 0.80 (P0.001) and -0.277 (P0.10), respecti

6、vely. The correlation between the ratio of type I/III collagen and the ratio of type / procollagen mRNA was positive (r=0.47, P0.05).ConclusionIncreased collagen and the ratio of type / collagen are the characteristics in collagen remodeling of the hypertrophic right ventricle in TOF. Enhanced type

7、procollagen gene expression may be the cause of the increased collagen synthesis. 【Key words】tetralogy of Fallotmyocardiumcollagenfibrosis 左室心肌間質(zhì)纖維化已日漸引起人們的重視，心肌間質(zhì)纖維化是心力衰竭(心衰)進展中的有害因素之一。右室肥大是否和左室肥大一樣面臨同樣的問題? Bishop等對動物右室肥大模型的研究結(jié)果表明：早期間質(zhì)膠原不一定增加，后期則有明顯增加，/型膠原比值亦升高，其原因是由于膠原基因mRNA的水平上調(diào)。對于人類，Schwartz等報道嬰

8、兒時期法樂四聯(lián)癥的右室膠原面積百分比與正常對照組相差無異，而李新民等觀察到法樂四聯(lián)癥患者右室心肌間質(zhì)有纖維化，但缺乏定量研究。鑒于此，筆者著重研究法樂四聯(lián)癥患者右室肥大時心肌間質(zhì)纖維化的主要組成部分即膠原的改建和前膠原基因mRNA的表達，為進一步研究心肌間質(zhì)膠原改建的防治提供依據(jù)和新的途徑。 資料與方法 1.病例：術(shù)前和術(shù)中確診并行法樂四聯(lián)癥根治術(shù)的患者共22例，年齡 1.529歲，平均（8.7±6.4）歲；同期非心血管病及膠原系統(tǒng)疾病死亡者為對照組共8例，平均年齡（6.4±5.7）歲，兩組間年齡差異無顯著性(P0.05)。 2.膠原分析：法樂四聯(lián)癥組和對照組切取右室流出道

9、心肌組織塊，剪去心內(nèi)膜，預(yù)冷 PBS沖洗后液氮速凍，貯存于-70。用TRIzol試劑盒一步法提取總蛋白，用改良堿水解法測定羥脯氨酸（標準羥脯氨酸購自中國科學(xué)院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司），按Lowry法測定總蛋白濃度，然后參照Tanaka和Honda的方法提取膠原，經(jīng)SDS-PAGE電泳并以對應(yīng)于標準、型膠原蛋白（Sigma產(chǎn)品）區(qū)帶的積分值進行膠原/型比值分析。 3.探針:(1)含型前膠原1鏈cDN A探針簡稱 pro 1()探針的PUC 18重組質(zhì)粒由美國康涅狄格大學(xué)健康中心兒科的U. Rowe和B.E Kream惠贈，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提、酶切、純化，得到1.3kb pro 1() 探針；（2）

10、pro 1()探針為 4.5 kb cDNA(由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所劉秉慈老師提供)；（3）內(nèi)對照選用雞的磷酸-3-甘油醛脫氫酶（GAPDH）探針，片段大小為0.6 kb（由湖南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所江寧博士提供）。 4.心肌組織總RNA的提取和雜交：用TRIzol試劑盒一步法提取心肌組織總的RNA，以放射性同位素32P為標記物，隨機引物試劑盒標記探針，各點上樣量為20 g,用斑點雜交法檢測 mRNA，將膜上各點pro 1()、pro 1()的灰度面積積分除以同一膜上GAPDH的灰度面積積分即為各型mRNA的表達強度。 5.數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組

11、間比較采用方差分析，t檢驗和t檢驗， 法樂四聯(lián)癥組膠原含量與前膠原基因表達的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。 結(jié)果 1.法樂四聯(lián)癥組心肌間質(zhì)膠原含量（以羥脯氨酸含量代表）平均（14.85±2.48） g/mg總蛋白，較對照組平均(7.55±1.89) g/mg總蛋白明顯增多，P0.05； 法樂四聯(lián)癥/型膠原比值5.10±1.84，較對照組2.27±0.58顯著增高，P0.05。 2.法樂四聯(lián)癥組右室心肌間質(zhì)膠原含量與型膠原基因表達強度相關(guān)性分析顯示，兩者呈正相關(guān)， r=0.80，P0.001；與型膠原基因表達強度的相關(guān)分析顯示，其相關(guān)系數(shù)為-0.277， P0.1

12、0，差異無顯著性。右室心肌間質(zhì)膠原/型比值與/ 型膠原基因表達強度比值的相關(guān)分析顯示，兩者呈正相關(guān)(r=0.47，P0.05)。 討論 心肌組織包括心肌細胞和間質(zhì)，間質(zhì)約占心肌組織體積的25%，由細胞和基質(zhì)組成，其中含有內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及成纖維細胞等5。膠原為間質(zhì)基質(zhì)的主要成分，由型和型膠原構(gòu)成，其中80%以上為型，型僅占11%左右，此外還有少量型及型膠原等6。 Eghbail 等7用原位雜交法在離體心臟細胞上檢測、型膠原mRNA，發(fā)現(xiàn)只在成纖維細胞上表達，而心肌細胞未見表達?，F(xiàn)一般認為，心成纖維細胞合成分泌心肌間質(zhì)膠原，一些文獻報道在動物的右室肥大模型中觀察到右室肥大時其心肌間質(zhì)膠原有一動態(tài)改建過程：早期間質(zhì)膠原不一定增加，后期則有明顯增加，/型膠原比值亦升高， 其原因是由于成纖維細胞膠原基因mRNA的水平上調(diào)。 Schwartz則在研究主動脈閉鎖嬰兒（58個月）的右室心肌間質(zhì)膠原并與法樂四聯(lián)