常染色體顯性遺傳多囊腎的多囊素表達(dá)

1、    常染色體顯性遺傳多囊腎的多囊素表達(dá)        【摘要】目的研究多囊素的細(xì)胞定位，了解正常腎臟與腎組織多囊素的表達(dá)及分布差別。方法應(yīng)用多囊素合成肽單抗-抗pepPBP1和抗pepPBP3以及融合蛋白抗體-抗fpAH4，對3例正常腎組織和8例多囊腎組織的標(biāo)本做免疫組織化學(xué)染色定位。結(jié)果正常腎組織的多囊素組織化學(xué)定位主要分布在遠(yuǎn)端小管和集合管，髓質(zhì)部更明顯，近端小管弱染或陰性，腎小球上皮細(xì)胞也可著染。8例多囊腎組織的染色細(xì)胞在28%60%，大多數(shù)為50%，囊腫上皮染色比

2、正常腎組織強(qiáng)，囊腫上皮染色強(qiáng)弱不同，少數(shù)囊腫上皮染色陰性。結(jié)論正常腎組織和多囊腎組織均可表達(dá)多囊素，多囊素染色以遠(yuǎn)端小管和集合管為主，細(xì)胞染色有差異性；多囊腎的囊上皮染色存在異質(zhì)性?！娟P(guān)鍵詞】多囊腎免疫組織化學(xué)多囊素 Expression of polycystin in autosomal dominant polycystic kidney diseaseYE Chaoyang*，Dominique Droz.*Department of Nephrology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shangha

3、i 200003【Abstract】ObjectiveIn order to identify the localization of polycystin(PC) in the cells and understand the expression and distribution difference of PC in the normal kidney and polycystic renal tissue. MethodsThe antibodies against 2 synthetic peptides, pepPBP1 and pepPBP3, and a fusion prot

4、ein fpAH4 corresponding to the predicted amino acid sequence of PC were used for immunostaining of normal renal and polycystic tissues. ResultsIn 3 cases of normal tissue ,PC was mainly localized to distal and collective tubeles with a finely granular cytoplasmic staining, especially in the medulla;

5、 proximal tubules was faintly positive or negative. In 8 cases of polycystic kidney, 28%60% of the cells were positive, being near 50% in the majority of cases; approximately 80% of non-cystic tubules expressed PC and cells staining were stronger positive than normal kidney. ConclusionPC is expresse

6、d either in polycystic kidney or in normal renal cells; PC is detected in cell lining nearly 50% of cysts wall also exhibiting some intercellular heterogeneity.【Key words】Autosomal dominant polycystic kidney diseaseImmunohistochemistryPolycystin常染色體顯性遺傳多囊腎?。ˋDPKD）是腎功能衰竭病因中最常見的遺傳病，發(fā)病率為1/1000，多囊腎的發(fā)病目前

7、認(rèn)為與三個位點(diǎn)有關(guān)，即PKD1,PKD2和PKD3。PKD1定位于染色體16p133，PKD2定位于染色體4q1323，但PKD3還未明確定位。多囊腎的基因突變85%90%是PKD1基因突變，PKD1基因目前已被克隆，其產(chǎn)物為多囊蛋白（或稱多囊素）的氨基酸序列業(yè)已查清，它是一個相對分子質(zhì)量約460的跨膜糖蛋白，有一個很大的細(xì)胞外N-末端和一個細(xì)胞內(nèi)C-末端尾巴1。盡管多囊素的功能還未澄清，根據(jù)其細(xì)胞外的多個功能區(qū)，目前認(rèn)為它發(fā)揮細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)胞與間質(zhì)之間的相互作用。本研究中，我們采用基因克隆多囊素多肽抗體或融合抗體，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，試探討多囊素在多囊腎組織中的分布和多少，以便進(jìn)一步推測

8、其功能。材料和方法一、材料8例多囊腎組織標(biāo)本，均為女性，6例為腎移植前切除腎，2例為多囊腎腹痛切除腎，腎切除時患者已行血液透析1個月至14年不等。正常腎組織來自3例因腎腫瘤行腎切除的非腫瘤腎組織。兩種兔抗鼠多囊素的合成肽單抗-抗pepPBP1 和抗pepPBP3以及一種多囊素融合蛋白單抗-抗fpAH4 由荷蘭的D. Peter 教授贈送。fpAH4 和pepPBP1均位于目前認(rèn)定的多囊素蛋白的細(xì)胞漿部分（即羧基端），pepPBP3多肽位于多囊素基因第24個外顯子編碼區(qū)（第2961-2975氨基酸），這三種抗體具有相同的免疫組織化學(xué)染色2。正常兔血清作為陰性對照。二、方法腎臟組織標(biāo)本福爾馬林固定

9、，石蠟包埋切片，切片厚度4 m。內(nèi)源性過氧化酶用3%雙氧水處理5分鐘，內(nèi)源性生物素活性用生物素抑制試劑合（Dako,Denmark）抑制。多囊素抗原恢復(fù)處理如下：切片浸入pH 6.0的枸櫞酸緩沖液，微波爐處理4分鐘，反復(fù)3次，原抗體適當(dāng)稀釋（1/2001/600），加到切片上，孵育一小時；免疫酶標(biāo)染色應(yīng)用LSAB2 過氧化酶試劑盒（Dako Denmark）,用3-氨基-9-乙基-卡巴砷作為顯色底物；組織切片再用蘇木素逆染。每例標(biāo)本均做連續(xù)切片，分別用三種抗體和正常兔血清染色。為了確定囊腫的來源，3例多囊腎標(biāo)本作了連續(xù)切片，應(yīng)用花生刀豆素過氧化酶染色，分別鑒定遠(yuǎn)端、近端小管和集合管?？筬pAH

10、4融合蛋白抗體也采用過氧化酶法用于囊腫和腎小管多囊素表達(dá)的檢測，刀豆素標(biāo)記的過氧化酶采用二氨基苯乙啶為底物，顯褐色。結(jié)果一、多囊素在正常腎組織的表達(dá) 在正常腎組織中三種抗體均有著染，三種抗體的免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度相近；而用正常兔血清處理的腎組織標(biāo)本染色完全陰性。在腎小球，足細(xì)胞的著染主要在胞漿，靠近核周圍，壁層上皮染色很弱且散在；系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞不著染。遠(yuǎn)端小管和集合管染色強(qiáng)陽性伴有細(xì)顆粒的胞漿著色，集合管的頂端和底部清楚著色，髓質(zhì)部更為明顯；近端小管弱染或陰性。二、多囊素在多囊腎組織的表達(dá)多囊素在多囊腎的表達(dá)比正常腎組織更為強(qiáng)染色。1.腎囊腫組織：在所研究的8例多囊腎組織，多囊素在囊襯里上

11、皮細(xì)胞的胞漿中檢測到。這8例的少數(shù)囊上皮染色陰性。多囊素染色陽性的細(xì)胞占28%60%，大多數(shù)為50%（1），此外，即使在同一個囊腫的上皮細(xì)胞，6/8例腎組織囊腫細(xì)胞的著染存在差異性，某些陰性染色的囊上皮細(xì)胞比鄰的細(xì)胞可以出現(xiàn)陽性染色；即染色存在異質(zhì)性。2.非囊腫腎組織的多囊素表達(dá)（2）：組織化學(xué)染色所見約80%的非囊腫的腎小管表達(dá)多囊素，免疫染色呈顆粒狀，在某些腎小管的細(xì)胞膜（頂端和基底部）染色增強(qiáng)，尤其在集合管。在著染的陽性細(xì)胞也存在差異性，陽性細(xì)胞的臨近細(xì)胞也可有陰性細(xì)胞，增生肥大的腎小管細(xì)胞染色強(qiáng)陽性。在腎小球，上皮細(xì)胞染色陽性如同正常組織。1多囊素在多囊腎囊腫表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色（光

12、鏡×400）2多囊素在非囊腫腎組織的表達(dá)情況（光鏡×400）討論越來越多的研究表明，多囊素（或稱多囊蛋白）是遺傳性多囊腎病的重要因素，應(yīng)用多囊素單克隆抗體或多克隆抗體檢測多囊素在腎臟的表達(dá)已有報(bào)道3-5，各家的報(bào)道不盡相同，但都認(rèn)為多囊素既可在多囊腎囊腫上皮表達(dá)，也可在正常成熟的腎臟表達(dá)。我們的研究表明，多囊素在正常腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，主要是在遠(yuǎn)端小管和集合管，而近端小管基本上是陰性的，本組的石蠟切片標(biāo)本，多囊素的免疫組織化學(xué)染色主要是呈胞漿性，細(xì)胞膜染色或核周染色也可見到。一般認(rèn)為，這與所用抗體（單抗或多抗）和組織處理（福爾馬林或冰凍切片）有關(guān)；本組所用基因重組抗體是抗多

13、囊素的胞漿部分，其結(jié)果也相吻合。這些觀察結(jié)果支持目前所認(rèn)定的多囊素作用，即多囊素在細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間發(fā)揮作用。我們的研究表明6，在培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察多囊素定位于單側(cè)細(xì)胞膜，在細(xì)胞與細(xì)胞接觸點(diǎn)探測到多囊素；晚近研究表明，雙共聚焦顯微鏡證明多囊素與細(xì)胞骨架成分鈣調(diào)素（cadherin）位于相同部位；另一組研究證實(shí)多囊素與整合素21和肌動蛋白細(xì)絲相結(jié)合，有趣的是整合素21存在于遠(yuǎn)端小管和集合管，而近端小管不存在。本組在成熟的足突細(xì)胞檢測到多囊素，染色主要是細(xì)胞體，這與個別報(bào)道不同（他們在腎小球上皮細(xì)胞未檢測到多囊素）。在這些細(xì)胞，多囊素的免疫組織化學(xué)染色可能與多囊素分

14、子結(jié)合到肌動蛋白細(xì)絲有關(guān)。我們研究所用的ADPKD組織，在囊腫上皮細(xì)胞的胞漿有多囊素的強(qiáng)陽性表達(dá)，表達(dá)陽性率達(dá)50%，但存在細(xì)胞間的差異性，甚至部分囊腫上皮細(xì)胞呈陰性，這種結(jié)果可能與囊腫的局部解剖起源有關(guān)；也就是說，陰性的囊腫可能來源于近端小管或包曼氏囊，不表達(dá)多囊素；而陽性的囊腫來源于遠(yuǎn)端小管或集合管，表達(dá)多囊素。另一種可能是陰性與陽性囊腫的不同支持這樣一個觀點(diǎn)：ADPKD的發(fā)生與PKD1基因“二次打擊”理論相符；根據(jù)這種理論，陰性囊腫其PKD1基因改變導(dǎo)致整個蛋白丟失，而陽性囊腫細(xì)胞的基因改變導(dǎo)致一種無功能的多囊素形成?？傊?，多囊素的功能研究才剛剛開始，多囊素的結(jié)構(gòu)分析表明，它是一個很大的

15、分子，具有五個細(xì)胞外蛋白分子片段區(qū)域，如乳糖結(jié)合區(qū)、LDL-A區(qū)、纖維連結(jié)蛋白結(jié)合區(qū)等；多囊素還具有免疫球蛋白重復(fù)區(qū)。多囊素可能具有復(fù)雜的功能，在細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間發(fā)揮作用可能只是其功能的一部分。多囊素的抗體多種多樣，不同節(jié)段的抗體可能出現(xiàn)不同的免疫組織化學(xué)結(jié)果。多囊素在非ADPKD腎囊腫上皮細(xì)胞的表達(dá)情況如何以及其作用，都是值得進(jìn)一步研究的。作者單位：葉朝陽200003 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院腎內(nèi)科；Dominique DrozService de Nephrologie et INSERM U90,Hospital Necker,75015 Paris,France參考文獻(xiàn)

16、1The international polycystic kidney disease consortium.Polycystic kidney disease: the complete structure of the PKD1 gene and its protein. Cell,1995，81:289-298.2Peters DJM, Spruit L, Klingel R, et al. Adult,fetal, and polycystic kidney disease 1 gene product. Lab Invest,1996， 75:221-230.3Van Adelsb

17、erg J,Chamberlain S, DAgati V. Polycystin expression is temporally and spatially regulated during renal development. Am J Physiol，1997，273：(Renal Physiol 41 ):F602-F609.4Geng L, Segal Y, Peissel B, et al. Identification and localization of polycystin, the PKD1 gene product. J Clin Invest，1996，98:2674-2682. 5Ward CJ, Turley H, Ong ACM, et al. Polycystin, the polycystic kidney disease 1 protein, is expressed by epithelial cells in fetal, adult, and polycystic kidney. Proc Natl Acad Sci