基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法

1、基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法江西省臨床檢驗(yàn)中心應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR ）技術(shù)測(cè)定臨床標(biāo)本中的病原體核酸成分，是一種高度敏感，且最為直接的檢測(cè)手段。由于臨床標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，可干擾PCR 反應(yīng)，故在做PCR 反應(yīng)前必須進(jìn)行核酸提取。經(jīng)典的核酸提取方法通常是加去污劑（SDS 等）裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。由于樣本的處理及保存對(duì)DNA和RNA （尤其是RNA ）的影響較大，因此在核酸測(cè)定時(shí)標(biāo)本的處理及適當(dāng)保存對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確有效非常重要。臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血清（漿）、全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、石蠟切片等，這些臨床標(biāo)本的處理和保存方

2、法各有不同。臨床標(biāo)本的處理血清（漿）標(biāo)本一些病原體，如乙肝病毒（HBV ）、丙肝病毒（HCV ）、人類免疫缺陷病毒（HIV ）等的PCR 檢測(cè)常采用血清或血漿標(biāo)本。HBV ：標(biāo)本通常由醫(yī)護(hù)人員采集，應(yīng)注意避免溶血，如為血漿標(biāo)本注意抗凝劑的選擇，一般用EDTA-Na2或枸櫞酸納，不可使用肝素。標(biāo)本為全血時(shí)，及時(shí)分離出血漿，提取病毒DNA 進(jìn)行檢測(cè)。HCV ：檢測(cè)RNA 病毒。由于RNA 極易降解，標(biāo)本的制備和保存方式往往可以影響測(cè)定結(jié)果。若用血漿標(biāo)本，應(yīng)使用EDTA 抗凝。嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR 擴(kuò)增有抑制作用,且無(wú)法在核酸提取過(guò)程中去除?？鼓?小時(shí)內(nèi)分離血漿。如用血清標(biāo)本，則應(yīng)盡快（2小

3、時(shí)內(nèi)）分離血清進(jìn)行檢測(cè)，或-20oC 保存。全血標(biāo)本通常用來(lái)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞核酸：如基因組DNA 、線粒體DNA 、總RNA 等?？鼓齽阂话闶褂肊DTA-Na2、枸櫞酸納，不使用肝素。前處理：1）加適量的紅細(xì)胞裂解液（破膜液），裂解全血中的紅細(xì)胞。2）再加適量的細(xì)胞核裂液（破核液），裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA 釋放出來(lái)。3）然后再加SDS （十二烷基硫酸鈉）等去污劑，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。SDS 可與蛋白質(zhì)結(jié)成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀，但SDS 在以后的核酸提取過(guò)程中必須除去。痰標(biāo)本痰屬于分泌物，臨床上常用作結(jié)核桿菌DNA 測(cè)定樣本，由于痰標(biāo)本中含大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取

4、時(shí)，一定要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等經(jīng)典法提取DNA 。具體方法：用無(wú)菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml ，加入4倍體積，搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室溫放10分鐘12000 rpm，離心15分鐘棄上12000rpm 清，加離無(wú)菌生心5分理鐘鹽水1 ml ，棄上清，沉淀物用于DNA 提取，混勻棉拭子用PCR 方法檢測(cè)性病病原體時(shí)（衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、人乳頭狀瘤病毒等），臨床標(biāo)本一般為棉拭子。標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體等病原體感染上皮細(xì)胞，因此取材

5、一定要取到細(xì)胞。具體方法：加1ml 無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩混勻，12000rpm ，離心5分鐘用棉拭子取尿道分泌物或?qū)m頸分泌物（由醫(yī)護(hù)人員采集），置無(wú)菌試管或EP 管內(nèi)棄上清理鹽水1ml ，打勻，離心5分鐘同上，重復(fù)洗滌一次棄上清，沉淀即可用于DNA 提取5體液體液標(biāo)本，包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等，可直接離心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用紅細(xì)胞裂解液處理：加等體積紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，置5-10分鐘10000rpm ，離心5分鐘，棄上清可根據(jù)情況重復(fù)2-3次，沉淀物用于DNA 提取6膿液粘稠膿液：同痰標(biāo)本處理，先用4%NaOH液化，再離心取沉淀提取DNA 。水樣膿液：直接離心，沉

6、淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA 提取。7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K 消化后提取核酸石蠟切片用于核酸提取，需先用二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K 消化后進(jìn)行DNA 提取。標(biāo)本的保存血清（漿）HBV ：分離出的血清（漿）如不立即提取核酸，保存于-20oC 待檢。HCV ：盡快分離血清(漿, 如不立即提取RNA ，保存于-20oC 待檢。長(zhǎng)期保存：吸取200µl 血清，加20u RNasin（RNA 酶抑制劑），保存于-70C 。已發(fā)出結(jié)果報(bào)告的標(biāo)本應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至冰箱保存，并由專人負(fù)責(zé)管理，保存1-2周（時(shí)間長(zhǎng)

7、短根據(jù)報(bào)告單上的承諾而定）。全血標(biāo)本全血標(biāo)本如用于DNA 提取，可4oC下短期保存（數(shù)天），時(shí)間長(zhǎng)易降解，如用于RNA 檢測(cè)，應(yīng)在取血后盡快提取RNA 。最好將DNA 或RNA 提取后，置-70oC 保存。痰液化的痰標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC 。處理后的棉拭子、體液、膿液如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC 。組織新鮮組織最好保存于50%乙醇中，具體方法：先用生理鹽水將組織洗一次，切成小塊，加入適量生理鹽水，然后邊搖邊加入無(wú)水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4oC 可保存6年。總而言之，標(biāo)本的保存及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理對(duì)核酸模板的成功提取具有決定性作用。

8、要強(qiáng)調(diào)的是，所有用于上述處理的容器如試管或離心管，均應(yīng)在使用前壓滅菌。核酸的提取核酸包括DNA 、RNA 兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主要步驟為：裂解細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA 分子時(shí)，應(yīng)去除RNA ，反之亦然。沉淀核酸純化核酸，去雜質(zhì)除鹽類，有機(jī)劑等(一DNA 提取的經(jīng)典方法DNA 提取的經(jīng)典方法，即所謂的酚-氯仿提取法。因?yàn)槭褂脙煞N不同的有機(jī)溶劑交替抽提更容易將蛋白除去，提取次序?yàn)榉?、?氯仿（1：1）、氯仿，這種方法提取的DNA 純度高、片段大、效果好，缺點(diǎn)是較為繁瑣。經(jīng)前處理的標(biāo)本加入蛋白酶

9、K, 搖勻56oC 溫育1小時(shí), 或37 oC消化6小時(shí)以上/過(guò)夜加入等體積飽和酚, 充分混勻12000rpm, 離心5分鐘將上層水相移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積酚/氯仿(1:1混合液，混勻12 000rpm，離心5分鐘取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積氯仿，混勻后12000rpm ，離心5分鐘取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，沉淀DNA搖勻，可見(jiàn)白色絮狀DNA ，置-20oC ，30分鐘或過(guò)夜12000rpm ，離心5分鐘棄上清，用預(yù)冷70%乙醇洗兩次，室溫干燥5分鐘加適量TE 緩沖液或無(wú)菌去離子H2O 溶解DNA ，混勻紫外分光光度儀測(cè)OD 值，4oC 備用說(shuō)明：回收

10、上層水相時(shí)，一定不要接觸兩相的界面，以免將蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸入新離心管。沉淀DNA ，無(wú)水乙醇是首選的有機(jī)溶劑。另：異丙醇、醋酸鈉等。70%乙醇漂洗DNA ，是為了去除殘余的鹽類，去除過(guò)量SDS 和酚等雜物，因?yàn)镾DS 在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA 共沉淀，從而通過(guò)棄上清液去除這種去污劑, 避免對(duì)以后PCR 反應(yīng)的影響。TE 緩沖液：10mmol/L Tris-Hcl1mmol/L EDTA pH 8.5或8RNA 的提取RNA 提取條件較DNA 要求嚴(yán)格，主要是因?yàn)榕R床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，存在大量對(duì)RNA 有強(qiáng)烈降解作用RNase 。RNase 是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類。這種酶耐

11、酸、耐堿、耐高溫，如煮沸也不能使之完全失活。蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時(shí)失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。除細(xì)胞內(nèi)RNase 以外，環(huán)境中灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿和試劑、人體的汗液及唾液中均存在RNase ，因此在提取RNA 時(shí)，關(guān)鍵要避免RNase 對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase 對(duì)提取的RNA 的降解。1提取RNA 所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備塑料制品：如試管、EP 管、Tip 頭，使用滅菌的一次性用品。玻璃用品：如燒杯、試管和其他用品，常被RNase 污染，使用前必須于180oC 干燥8小時(shí)以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯浸泡處理。DEPC 是RNase 的強(qiáng)抑制劑，作用機(jī)制是通過(guò)與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。37oC浸泡2小時(shí)，然后用滅菌水漂洗數(shù)次，于100oC 干烤15分鐘，去除器皿上殘余DEPC 。所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA 提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無(wú)RNase 的玻璃器皿。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，所有溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37oC 處理12小時(shí)以上，然后于100oC 加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC 。2RNA 提取中RNase 污染的控制最主要的潛在污染源是操作人員的手，手直接觸摸之處毫無(wú)疑問(wèn)會(huì)留下RNase ，另外，說(shuō)話帶出的唾液也富含R