反義雷帕霉素靶蛋白基因局部轉染對移植靜脈內膜增生的影響

1、反義雷帕霉素靶蛋白基因局部轉染對移植靜脈內膜增生的影響                作者：胡新華 張強 楊軍 劉程偉 張志深 楊德華  【摘要】目的：觀察以納米粒子為載體的反義雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部轉染對移植靜脈內膜增生的影響。方法：應用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包載mTOR基因，制備納米級粒子混合物。檢測其包埋率、體外釋放情況及粒子大小。建立自體靜脈移植模型，隨機分成轉基因組、空載體組、對照組。

2、轉基因組移植靜脈轉染以納米粒子為載體的反義mTOR基因，空載體組單純轉染納米粒子包載的空載體，對照組不予特殊處理。分別于術后3d、7d、14d、28d取材，常規(guī)HE、Verhoeff染色，RTPCR、Western blot檢測mTOR基因的mRNA及蛋白的變化，TUNEL法觀察血管平滑肌細胞（VSMC）凋亡的動態(tài)變化。結果：轉基因組內膜中mTOR基因的mRNA及蛋白產物表達較其他兩組明顯減少（P0.05）；轉基因組內膜增生厚度7d、14d、28d較其他組明顯減少（P0.01）；轉基因組凋亡細胞較其他組明顯增高（P0.05）。結論：納米粒子可以作為轉基因載體，反義mTOR基因的表達能夠有效抑制

3、自體移植靜脈內膜的增生，促進VSMC的凋亡。    【關鍵詞】雷帕霉素靶蛋白基因轉移，水平內皮，血管靜脈移植，自體納米粒子    【ABSTRACT】Objective:To study the effect of antisense mammalian target of rapamycin(mTOR)gene transfection mediated by nanoparticles (NP)on neointimal formation in rat vein grafts.Methods:Nanoparticle antis

4、ense mTOR gene complex was prepared with PLGA package.The efficiency,release process in vitro and size of the complex were determined.Autogenous vein graft model was established in 72 rats by transplanting internal branch of jugular vein to carotid artery.Three groups were studied:(1)antisense mTOR

5、group:antisense mTOR gene mediated by NP were transfected into the veins before anastomosis.(2)Empty vector group:the vein were transfected by empty vector mediated by NP.(3)Control group(no transfection).The grafted veins were harvested 3 day,1 week,2 week and 4 week after the operation respectivel

6、y.The exogenous mTOR mRNA and protein expression were determined by RTPCR and Western blot.Intimal hyperplasia(IH) were observed by HE and Verhoeff stain.The presence of apoptotic VSMC was detected by TUNEL stain.Results:Antisense mTOR gene transfection mediated by nanoparticle complex enabled to in

7、hibit the mRNA and protein expression of mTOR gene(P0.05),and the IH was inhibited in the vein graft especially during 7d28d(P0.01).Conclusion:Nanoparticle is an effective gene transfecting carrier,and antisense mTOR gene expression can prevent the IH and promote apoptosis after vein grafting. 

8、   【KEY WORDS】Veins mTORGene transfer,horizontalTransplantation,autologousNanoparticleEndothelium,vascular     利用自體靜脈行冠狀動脈搭橋或肢體旁路轉流手術，是目前挽救病人生命和肢體功能的重要手段。但是，血管移植后狹窄、閉塞使手術遠期失敗率高達40%60%。哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）作為一種重要的信號傳導分子，參與細胞的多種生理和病理過程，在細胞的生存、生長

9、及增殖過程中起中心調控作用1。我們已經成功構建mTOR基因的反義RNA真核質粒表達載體2。本研究中，我們以納米粒子為載體局部轉染反義mTOR基因，觀察其對移植血管內膜增生的影響。    1  材料與方法    1.1  實驗材料  Wistar大鼠72只，雌雄不拘，體重250300g。重組質粒pEGPClmTOR為我們自行構建。聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）由中國醫(yī)學科學院生物工程研究所提供。TUNEL法凋亡檢測試劑盒為武漢博士德公司產品。mTOR多克隆抗體為Santa Cruz公司產品。

10、    1.2  納米微粒包載反義mTOR基因DNA質粒  將反義mTOR基因pEGPClmTOR質粒加入適量PLGA二氯甲烷溶液中，在冰浴條件下用高速攪拌器進行乳化，形成油包水型乳液后，再加入PVA水溶液，攪拌形成均一的水包油包水乳液，于通風櫥內常壓下攪拌揮發(fā)有機溶劑2h，高速離心機離心20min，收集沉淀，水洗除掉游離的基因及PVA后，冷凍干燥。    1.3  納米粒子粒徑及分布的測定  采用激光子相關光譜儀（PCS美國Brookhaven公司），BI9000AT相關器，BI200SM光度

11、計，Innova304氬離子激光器（美國Coherent公司）于25±0.1，進行激光光散射的測定。納米粒子表面形態(tài)的觀察：將包裝了pEGPClmTOR質粒DNA的納米粒子溶于蒸餾水中，滴加于蓋玻片上，自然干燥，噴金掃描。         1.4  載基因納米粒子體外釋放試驗  稱量含pEGPClmTOR質粒DNA的納米粒子15.5mg,加入TE溶液中制成均一的懸浮液，將其放入雙室擴散池的一側，兩池之間用0.22的濾膜隔開，另一側為接收池，存放等體積新鮮的TE釋放液，將此雙室擴散池置于37130

12、min的恒溫搖床中進行釋放實驗，每24h用新鮮緩沖液更換接收池中的釋放液，更換出的樣品直接用紫外分光光度計在波長260nm處測定吸光值，計算出釋放量繪制累積釋放曲線。    1.5  實驗動物分組及局部基因定位轉染  72只大鼠，隨機分成轉基因組、空載體組、對照組。轉基因組：移植靜脈轉染以納米粒子為載體的pEGPClmTOR質粒。空載體組：轉染納米粒子包載的pEGPCl空質粒載體。對照組：不予特殊處理。每組24只，分別于術后3d、7d、14d、28d取材。建立大鼠自體靜脈移植模型：應用顯微外科技術，取頸總靜脈內側支5mm，轉基因組將移植靜脈段置

13、于已準備好的DNA溶液（稱量DNA納米粒子6mg，加入生理鹽水0.3ml，制成均一的懸浮液）中30min后取出靜脈，切斷同側頸總動脈，應用110無創(chuàng)縫合線將靜脈段端端吻合于同側頸總動脈；空載體組使用納米粒子包載的pEGPCl空質粒；對照組使用生理鹽水。各組動物分別于規(guī)定時間切取移植靜脈段，液氮中凍存。    1.6  形態(tài)學研究  參照文獻3，取部分標本于10%中性福爾馬林液固定過夜。石蠟包埋后切片，作HE染色、Verhoeff彈力纖維染色。TUNEL法檢測VSMC凋亡。計算機圖像分析儀分析Verhoeff切片，測量內膜厚度；分析TUNEL，計

14、算陽性細胞百分率。    1.7  RTPCR檢測反義mTOR基因的整合  根據反義mTOR序列設計引物：F：5AGGCCTTG GTGAGAGCTGTA3，R：5GGCACACATTTGAAGAAGCA3，產物長度322bp；actin F：5TTCTGACCCATACCCACCAT3，R：5ATTACAGTGCGTGCTAAAGG3，產物長度508bp。各取約100mg組織，按Trizol試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄為cDNA。PCR過程：20L反應體系，TaqDNA聚合酶0.5U，引物各50pmol。PCR反應條件：94變性2min后，

15、9430s、5645s、7245s順序共循環(huán)30次，最后72延伸7min。電泳，凝膠成像系統(tǒng)上攝像并分析各條帶光密度值（基因表達值=mTOR/actin）。    1.8  Western blot檢測mTOR蛋白的表達  取組織加裂解液，勻漿，16000×g，4離心20min，取上清，測蛋白濃度；以50g上樣，經10%SDS聚丙酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，與mTOR多克隆抗體結合1h，再與二抗結合30min后顯影，凝膠成像儀分析結果。    1.9  統(tǒng)計學方

16、法  組內差異采用方差分析，組間比較采用t檢驗。    2  結  果    2.1  納米粒子粒度的測定  光散射粒度分布圖可以看出，制備的載pEGPClmTOR質粒DNA納米粒子的粒度集中分布在243343nm，平均粒度為288.9nm。粒徑呈窄分布，粒徑大小穩(wěn)定可靠，包封效率為60%，用紫外分光光度計測得DNA含量為3%。粒子的體外釋放開始階段存在爆破釋放，約1周后釋放量開始穩(wěn)定，釋放曲線緩慢上升，平穩(wěn)維持釋放18d以上（圖1）。納米粒子掃描電鏡測定：電鏡掃描觀察載反義mTOR的

17、納米粒子，其直徑在300nm左右。    2.2  局部基因轉染結果  靜脈移植12周，熒光顯微鏡下可見有較多轉染基因表達，分布于移植靜脈中層及內膜，見圖2；移植4周，轉染基因表達減少。圖2  熒光顯微鏡下觀察移植血管轉染基因的表達（略）    2.3  形態(tài)學研究結果  各組均可見移植靜脈內膜增厚,以1428d最為明顯。術后3d，對照組及空載體組的內膜增生厚度與轉基因組差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；術后7、14、28d，轉基因組內膜增生程度明顯低于對照組及空載體組，差異有統(tǒng)計學意義

18、（P0.01），見圖3；對照組及空載體組比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），見表1。表1  移植靜脈內膜增生程度的比較（略）    2.4  TUNEL檢測凋亡結果  移植血管的凋亡細胞百分比在術后7d開始增高，14d達高峰，28d有所下降；轉基因組凋亡細胞增加明顯，在術后14d及28d與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；空載體組與對照組差異無統(tǒng)學計學意義（P0.05），見表2。表2  移植靜脈凋亡細胞百分比比較（略    2.5  RTPCR結果  轉基因組RNA經RT

19、PCR擴增后，可見特異性條帶322bp(圖4)；而空白對照組及空白納米粒子對照組未見特異表達條帶。這提示納米粒子可將外源反義mTOR基因導入移植血管并表達。         2.6  Western blot檢測蛋白產物表達  空載體組及對照組在術后37d即出現(xiàn)mTOR蛋白產物的表達，14d達到高峰，28d有所下降，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；轉基因組的mTOR蛋白產物表達在術后3d、7d、14d較對組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），見圖5。    圖5

20、  Western蛋白印跡檢測移植血管mTOR蛋白產物表達3  討  論基因治療的常用載體主要有腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、脂質體、陽離子聚合物等。病毒載體存在一些問題，如它們的免疫原性、原癌基因特性及一些未知的長期作用，而非病毒的載體則不存在這些問題。納米粒子是一種新興的非病毒基因載體，它可以使被包裹的DNA免受水解酶的降解。它在保護基因片段不受破壞的同時可以將目的基因定向運載到血管內的病灶部位，并能透過血管內皮間隙進入血管平滑肌細胞（VSMC），使基因在細胞內或周圍組織中長期貯存和釋放，起到治療作用，提高轉染基因的穩(wěn)定性4。本實驗所用的PLGA納米粒子具有很好

21、的組織相容性，已經應用于臨床，在人體內最終代謝產物為H2O和CO2，無任何毒性。本實驗制備的納米粒子大小在240350nm之間，包載效率0.3%，DNA通過滲透和擴散的方式釋放出來，釋放時間為2周左右，屬較大顆粒的納米粒子。mTOR是防治PTCA術后再狹窄藥物雷帕霉素的作用靶蛋白。現(xiàn)已證實，mTOR是一種分子量為289kDa的蛋白激酶，是3磷脂酰肌醇激酶相關激酶家族（PI3Ks）中FK506結合蛋白（FKBP12）的相關蛋白。mTOR信號通路在細胞的生存、生長及增殖過程中起中心調控作用，是細胞周期跨越G1/S期所必需的1。臨床研究結果表明，應用雷帕霉素藥物洗脫支架可以將PTCA術后再狹窄率降低

22、90%以上5。深入研究mTOR信號通路可能揭示人類許多疾病的發(fā)病機制或病理過程。在前期工作中，我們構建了mTOR的反義基因表達質粒載體，通過轉染離體培養(yǎng)的VSMC，初步證實其能夠抑制VSMC的增殖，而其在體的作用及機制則有待于深入研究。本實驗中，我們采用納米技術包裹反義mTOR基因進行局部轉染，通過動物模型的在體實驗研究，進一步觀察反義mTOR基因的表達效果，以及其對自體移植靜脈內膜增生程度的影響。實驗結果，我們成功檢測到反義mTOR的mRNA及其蛋白產物的表達，并且發(fā)現(xiàn)內膜增生受到顯著的抑制。本實驗證實，納米粒子作為基因載體是可行的、有效的，而反義mTOR基因的表達能夠有效抑制自體移植靜脈內膜的增生。我們推測，其作用機制可能是通過抑制VSMC增殖、促進VSMC的凋亡而實現(xiàn)的。我們的研究也表明，促進VSMC的凋亡可能是防治內膜增生新的有效途徑6。因此，mTOR可能成為防治內膜增生或移植血管狹窄、閉塞的新的藥物或基因干預靶點，對移植血管狹窄、閉塞機制研究有非常重要的作用。參  考  文  獻    1Fingar DC,Richardson CJ,Tee AR,et al.mTOR controls cell cycle progression