人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生形態(tài)學(xué)研究

1、    人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生形態(tài)學(xué)研究        【摘要】目的觀察人大隱靜脈在器官培養(yǎng)條件下是否發(fā)生內(nèi)膜增生。方法取30條人大隱靜脈段進行器官培養(yǎng)14d，冰凍切片，蘇木素-伊紅(HE)、彈性纖維染色以及抗-肌動蛋白(-actin)、增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色，與不培養(yǎng)的對照組進行組織形態(tài)學(xué)比較。結(jié)果培養(yǎng)14d后內(nèi)膜顯著增厚，增厚內(nèi)膜層中細胞為平滑肌細胞，增殖率為45%。結(jié)論體外培養(yǎng)的人體大隱靜脈將出現(xiàn)內(nèi)膜增生。內(nèi)膜增生是由于中層平滑肌細胞向內(nèi)膜層的移

2、行和增生，這與人大隱靜脈旁路移植術(shù)后病理改變相同。【關(guān)鍵詞】人大隱靜脈；器官培養(yǎng)；內(nèi)膜增生 Morphologic studies on endometrial hyperplasia of human saphenous vein in organ cultureWANG Yuqi, DAI Wangde, FU Weiguo, et al. Research Unit of Vascular Surgery, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China【Abstract】 Objective

3、 To investigate endometrial hyperplasia of human saphenous vein under the condition of organ culture. Methods Thirty saphenous vein segments were cultured for 14 days, frozen in liquid nitrogen and processed for Harris' hematoxylin and eosin and miller's elastic stain, as well as immunohisto

4、chemistry. Immunostaining of the frozen sections was performed with monoclonal anti-smooth muscle -actin and anti-PCNA antibody. Freshly excised vein segments were processed similarly as a control group. Results Human saphenous vein intimal thickness was increased significantly after cultured for 14

5、 days. The cells within neointima were smooth muscle cells (SMCs) with the proliferating index of SMCs within neointima being 45 %. Conclusion Endometrial hyperplasia of human saphenous vein in the organ culture might result from migration of medial SMCs into the intima and from proliferation.【Key w

6、ords】 Human saphenous vein; Organ culture; Endometrical hyperplasia為探討人靜脈內(nèi)膜增生的發(fā)生機理，Soyombo等1于1990年建立了人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生實驗?zāi)Ｐ?。我們對其加以改進，使方法更簡便易行，觀察到了同樣的內(nèi)膜增生，現(xiàn)報道如下。材料與方法1.材料：(1)組織轉(zhuǎn)送液配制：RPMI1640+20mmol/L HEPES+4000IU/L肝素+5mg/L二性霉素B。(2)組織清洗液配制： RPMI1640+20mmol/L HEPES+2.5mg/L慶大霉素+100mg/L青、鏈霉素+0.8mmol/L谷氨酰胺。(3)

7、組織培養(yǎng)液配制：RPMI 1640+2g/L NaHCO3+2.5mg/L慶大霉素+100mg/L青、鏈霉素+0.8mmol/L谷氨酰胺+體積分數(shù)為30%小牛血清。(4)臺盼藍液配制：pH7.4DPBS液中含質(zhì)量分數(shù)為0.01%臺盼藍。2.器官培養(yǎng)所用氣-液相界面系統(tǒng)制作：40目不銹鋼絲網(wǎng)剪成1.5cm×2.0cm長方形，長的一方兩端各折彎約0.4cm成直角，置直徑為60mm培養(yǎng)皿中，其上覆蓋擦鏡紙，建立界面培養(yǎng)系統(tǒng)。3.人大隱靜脈取材：選擇病程短、曲張靜脈局限于小腿、程度輕、無潰瘍及色素沉著的下肢靜脈曲張手術(shù)病例。取材部位在大隱靜脈近股靜脈入口處，長約3cm，用作培養(yǎng)的靜脈段外觀正

8、常，病理切片檢查無內(nèi)膜增生，共30例。4.器官培養(yǎng)步驟：(1)切取3cm長大隱靜脈，置組織轉(zhuǎn)送液內(nèi)室溫下立即送到組織培養(yǎng)實驗室。(2)手術(shù)顯微鏡下去除外膜和脂肪組織，縱向剪開靜脈，用細針從內(nèi)膜面張開，沖洗去除血細胞和凝血塊，用刀片以5mm間隔橫斷。這一階段用作分析的靜脈被視為新鮮分離的靜脈。(3)一部分靜脈片在質(zhì)量分數(shù)為0.01%臺盼藍液中室溫下溫育12min，評價內(nèi)皮細胞的完整性和活性，不作為器官培養(yǎng)材料。(4)在器官培養(yǎng)界面系統(tǒng)中加入組織培養(yǎng)液，液量以浸過擦鏡紙為準。靜脈片以內(nèi)膜面置擦鏡紙上。在37、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)14d，培養(yǎng)液23d更換1次。所有標本液氮保存?zhèn)溆谩?.

9、檢測指標及方法：(1)冰凍切片：液氮保存標本在LEICA CM1902恒冷箱切片機冰凍切片，片厚5m，切片置于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，干燥后用體積分數(shù)為100%丙酮固定5min備用。(2)常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)和彈力纖維染色：每個靜脈連續(xù)3張切片染色，用像分析系統(tǒng)對每張切片上不同3點進行內(nèi)膜厚度測定。(3)抗平滑肌-肌動蛋白(-actin)的單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色：冰凍切片固定后按免疫組織化學(xué)常規(guī)處理。TBS洗5min×3次。然后滴加體積分數(shù)為0.3%H2O2甲醇，室溫下30min；TBS洗5min×3次，清洗后加120正常羊血清，室溫保持15min以阻斷非特異反應(yīng)

10、；加特異性一抗(抗平滑肌-actin的單抗)37 60min后TBS浸洗5min×3次。再加1200稀釋的酶標二抗，37 30min后TBS浸洗5min×3次，用ABC在37反應(yīng)30，TBS浸洗5min×3次，DAB溶液顯微鏡下控制顯色，在出現(xiàn)強的特異性顯色而背景基本不著色時終止顯色反應(yīng)，蘇木素鹽酸復(fù)染，脫水，透明后用中性樹膠封片。顯色鏡下呈棕褐色標記的細胞為平滑肌細胞。(4)PCNA免疫組織化學(xué)分析：冰凍切片免疫組織化學(xué)分析步驟同上，第一特異性單抗用鼠抗人PCNA單克隆抗體，核染色呈棕褐色者為增殖期細胞。(5)UEA-1親合免疫細胞化學(xué)技術(shù)染色：冰凍切片常規(guī)處理

11、后在生物素結(jié)合的UEA-1中浸育60min，TBS染滌后再與ABC試劑浸育，DAB鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，再脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察呈棕褐色標記的細胞為內(nèi)皮細胞。(6)內(nèi)皮細胞掃描電鏡觀察：標本在4下用體積分數(shù)為2%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.4)固定24h后，再用質(zhì)量分數(shù)為1%餓酸固定2h，然后梯度乙醇脫水和臨界點干燥噴金，在掃描電鏡下比較培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞變化。結(jié)果1.內(nèi)皮細胞活力和表面形態(tài)：用臺盼藍染色和掃描電鏡觀察準備培養(yǎng)和培養(yǎng)14d后的內(nèi)膜面完整性。準備培養(yǎng)的靜脈臺盼藍著色部位靠近切口邊緣，掃描電鏡顯示內(nèi)皮細胞形態(tài)完整，有連續(xù)的內(nèi)皮細胞層，靜脈邊緣細胞形態(tài)多變，有完整的內(nèi)

12、皮細胞區(qū)，也有內(nèi)皮細胞剝脫后內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)暴露的區(qū)域。培養(yǎng)14d后的靜脈內(nèi)膜面無臺盼藍染色，掃描電鏡顯示中心區(qū)域與剛分離時相似，細胞間常有較大間隙。為進一步鑒別和定位內(nèi)皮細胞，橫斷面切片用UEA-1進行親合免疫細胞化學(xué)技術(shù)染色。新鮮靜脈在未著色的中層上有1層內(nèi)皮細胞單層，在中間部分是連續(xù)的，周圍部分有間隙。培養(yǎng)后的靜脈片內(nèi)膜面主要由內(nèi)皮細胞組成，間或有未著色細胞。2.內(nèi)膜厚度和細胞成分：培養(yǎng)前后的靜脈片冰凍切片HE、彈力纖維染色后進行像分析，測定各組內(nèi)膜厚度。培養(yǎng)前內(nèi)膜厚度為(3.5±2.0)m(n=30)，培養(yǎng)后內(nèi)膜厚度為(47.0±9.3)m(n=30)，培養(yǎng)前后內(nèi)膜厚度之

13、間的差異有非常顯著性(P0.01)。切片抗平滑肌-actin的單抗免疫組織化學(xué)染色，培養(yǎng)后靜脈片增厚內(nèi)膜中細胞成分標記為棕褐色，證明為平滑肌細胞。而新鮮靜脈切片中，大多數(shù)中層細胞標記顯示為平滑肌細胞，很多未標記的細胞在外膜層中，而內(nèi)膜層中沒有標記的細胞。PCNA免疫組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)14d后靜脈新內(nèi)膜中的平滑肌細胞的細胞核增殖抗原染色陽性，染色率達45%，表明增厚內(nèi)膜中平滑肌細胞增生活躍。討論本實驗結(jié)果顯示，大隱靜脈離體培養(yǎng)14d后均發(fā)生內(nèi)膜增生，增厚的內(nèi)膜是由中層平滑肌細胞向內(nèi)膜層移行和增殖而成。我們在此模型中觀察到的平滑肌細胞移行和增生現(xiàn)象的機理可能為：(1)已知內(nèi)皮細胞能通過分泌功能抑

14、制或促進內(nèi)膜增生的因子調(diào)節(jié)平滑肌細胞的移行和增生2。如果在培養(yǎng)條件下這種內(nèi)皮細胞來源的抑制因子產(chǎn)生減少，而促進內(nèi)膜增生的因子增加，靜脈管壁內(nèi)膜局部內(nèi)皮源性生長因子相對濃度則高，就產(chǎn)生了濃度梯度。內(nèi)膜局部抑制內(nèi)膜增生因子濃度降低，促進內(nèi)膜增生因子濃度則增加，引起中層平滑肌沿濃度梯度向內(nèi)膜層移行和增生。這可能是平滑肌細胞向內(nèi)膜移行和增生的原因。(2)有實驗證明，中層平滑肌細胞相互之間的接觸或與細胞外基質(zhì)成分的接觸可抑制平滑肌細胞的分裂增生2。靜脈移植后以及器官培養(yǎng)時靜脈內(nèi)膜面這種抑制作用可能下降，導(dǎo)致平滑肌細胞向內(nèi)膜移行和增生?；痦椖浚簢易匀豢茖W(xué)基金資助項目(39670685)作者單位：王玉琦（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）代望德（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）符偉國（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）姚秀玲（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）參考文獻1，Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in an or