雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究

1、化學(xué)與生物工程Chemistry &Bioengineering2006,Vol. 23No. 107雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究鄭楠, 劉杰(南昌大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江西南昌330029摘要:闡述了雙水相萃取原理, 詳細(xì)分析了影響雙水相萃取分離純化蛋白質(zhì)的各種因素, 探討了雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用并對(duì)其前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞:雙水相; 蛋白質(zhì); 分離純化; 影響因素中圖分類號(hào):TQ 02818Q 512+11文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1672-5425(2006 10-0007-03液-液萃取技術(shù)是化學(xué)工業(yè)中普遍采用的分離技術(shù)之一, 在生物化工中也有廣泛的應(yīng)用

2、。然而, 大部分生物物質(zhì)是有生物活性的, 需要在低溫或室溫條件下進(jìn)行分離純化, 而采用傳統(tǒng)萃取技術(shù)無法完成。雙水相萃取就是考慮到這種現(xiàn)狀, 基于液-技術(shù)。與傳統(tǒng)的液-, :體系含水量高, 可達(dá)80%以上; 蛋白質(zhì)在其中不易變性; 界面張力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等 , 使其在上、下相中的濃度不同K , (01110之間 , 因2雙水相萃取中影響蛋白質(zhì)分配的因素211聚合物的分子量同一類聚合物的疏水性隨分子量的增大而增強(qiáng)1, 當(dāng)聚合物的分子量減小時(shí), 蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。如在PEG 2Dext ran 系統(tǒng)中,PEG 的分子量減小或Dextran

3、的分子量增大都會(huì)使分配系數(shù)變大, 相反PEG 的分子量增大或Dext ran 的分子量減小會(huì)使分配系數(shù)變小。這是由于PEG 分子量增大時(shí), 它的疏水性顯著增強(qiáng), 使蛋白質(zhì)在上相的表面張力增大, 從而易于向下相分配。同理,Dext ran 的疏水性隨其分子量的增大而增強(qiáng), 使蛋白質(zhì)在下相的表面張力增大, 從而不斷向上相分配。212聚合物的濃度水-有機(jī)溶劑兩相體系的界面張力, 有助于強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞; 分相時(shí)間短, 一般只需515min ; 易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作; 萃取環(huán)境溫和, 生物相容性高; 聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護(hù)作用等。正是由于雙水相萃取技術(shù)的諸多優(yōu)勢(shì), 現(xiàn)已被廣泛用于蛋白

4、質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、細(xì)胞器等產(chǎn)品的分離和純化。1雙水相萃取原理雙水相體系是指某些高聚物之間或高聚物與無機(jī)鹽之間, 在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙夂笮纬傻幕ゲ幌嗳艿膬上嗷蚨嘞嗨囿w系。高聚物-高聚物-水體系主要依靠高聚物之間的不容性, 即高聚物分子的空間阻礙作用, 促使其分相; 高聚物-鹽-水體系一般認(rèn)為是鹽析作用的結(jié)果。雙水相萃取與水-有機(jī)相萃取的原理相似, 都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配, 不同之處在于萃取體系的性質(zhì)差異。當(dāng)生物物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后, 由收稿日期:2006-04-17在雙水相系統(tǒng)中, 界面張力很低并且隨結(jié)線長(zhǎng)度呈指數(shù)規(guī)律的增大。當(dāng)系統(tǒng)組成處于臨界點(diǎn)時(shí), 系線長(zhǎng)度為零, 上下相組

5、成相同, 蛋白質(zhì)均勻地分配在兩相中, 分配系數(shù)K =1。當(dāng)成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增加時(shí), 系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn), 系線長(zhǎng)度增大, 兩相性質(zhì)的差別也增大, 同時(shí)蛋白質(zhì)在兩相中的界面張力差別增大, 使其趨于向一側(cè)分配, 即K 值或增大超過1, 或減小低于1。作者簡(jiǎn)介:鄭楠(1982- , 女, 陜西人, 碩士研究生, 主要從事生化制藥方面的研究。E 2mail :zhengnan1982 。8213添加劑21311中性鹽鄭楠等:雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究/2006年第10期214pH 值鹽的種類對(duì)分配系數(shù)的影響主要反映在對(duì)相間電位的影響上2。中性鹽的種類不同, 其正負(fù)離子分

6、配系數(shù)也不同, 當(dāng)它在雙水相中電離時(shí), 為保持兩相的電中性, 產(chǎn)生了不同的相間電位, 從而影響蛋白質(zhì)的分配。如在PEG 2Dext ran 體系中加入NaClO 4或KI , 可增加上相對(duì)帶正電的蛋白質(zhì)的親和效應(yīng), 并迫使帶負(fù)電的蛋白質(zhì)進(jìn)入下相; 若加入Li 3PO 4情況則相反1。故只要改變界面電勢(shì)就可控制荷電蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入所需要的相中。鹽的濃度對(duì)分配系數(shù)的影響主要反映在對(duì)蛋白質(zhì)疏水性的影響上2。如Uf uk Gunduz 和K o nca K orkmaz 用PEG33502Dextran35000體系分配BSA 時(shí), 保持體系NaCl 濃度不等(0106mol L -1、011mol L -

7、1、012mol L -1、013mol L -1、0134mol L -1 , 發(fā)現(xiàn)在任一p H 值下, 隨著NaCl 濃體系p H 值會(huì)影響蛋白質(zhì)分子可離解基團(tuán)的離解度, 從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配。同時(shí)-p H 值還會(huì)影響緩沖離子如HPO 2、PO 344等的分配, 以改變相間電位來達(dá)到改變分配系數(shù)的目的。另外在研究分配系數(shù)與p H 值的關(guān)系時(shí), 若加入不同種類的中性鹽, 由于電位差的不同, 其相應(yīng)關(guān)系也不同1。215溫度溫度的變化影響相物理性質(zhì)的變化, 例如粘度和密度等, 從而影響蛋白質(zhì)的分配7。但總的來說, 溫度對(duì)分配系數(shù)的影響是通過對(duì)相圖的影響來間接達(dá)到的。在臨界點(diǎn)附近,

8、 溫度對(duì)相圖的影響最顯著, 對(duì)分配系數(shù)的影響最強(qiáng)。當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí), 溫度對(duì)相圖的影響較小, 分配系數(shù)對(duì)溫度的變化也不敏感。這是由于遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí), , 對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)。2, 或葡聚糖上引入帶電基團(tuán)來改變蛋白質(zhì)的分配。因相間電位差與電荷數(shù)成反比, 而每個(gè)葡聚糖分子上可引入的帶電基團(tuán)較多, 故效果較差。相反, 每個(gè)PEG 分子只含兩個(gè)羥基, 只需引入兩個(gè)荷電基團(tuán), 電場(chǎng)增大的效果就較好。Johansson 等已制得以下四種荷電PEG:帶正電的三甲胺基2PEG (TMA 2PEG 、氨基2PEG (PEG 2N H 2 和帶負(fù)電的PEG 2磺酸鹽(S 2PEG 、羧基2PEG (PEG 2COO H 8

9、。因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電情況來選擇荷電PEG , 以達(dá)到改變蛋白質(zhì)分配的目的。如紅血球蛋白在p H 值較小時(shí)帶正電(等電點(diǎn)為7 , 若將PEG 接上三甲胺基基團(tuán)后, 由于上相帶正電, 紅血球蛋白就不斷向下相富集; 同理, 當(dāng)p H 值較大時(shí), 由于受上相正電TMA 2PEG 的影響, 帶負(fù)電荷的紅血球蛋白則開始向上相富集。217疏水基團(tuán)在聚合物上接枝疏水基團(tuán)后, 疏水性成為影響蛋白質(zhì)分配的主要因素。這種疏水性的影響由連接在高聚物上疏水基的大小和蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)域的數(shù)量以及疏水區(qū)的粘結(jié)強(qiáng)度所決定。Shanbhag 和Axelsson 認(rèn)為, 通過比較蛋白質(zhì)在PEG 2Dext ran 體系和存

10、在部分P 2PEG (Palmitoyl 2PEG 的PEG 2Dextran 體系中的分配系數(shù), 可以衡量蛋白質(zhì)的疏水性。實(shí)驗(yàn)表明, 在P 2PEG 濃度很低的情況下, 血清白蛋白和乳球蛋白因度的增加, 分配系數(shù)先減小后增大, 且在012mol L -1處達(dá)到最小。這是由于BSA 水性隨NaCl 當(dāng)濃度為012mol L -BSA 也就最多, 3。21312有機(jī)溶劑在雙水相體系中添加少量有機(jī)共溶劑, 使得體系中的一部分水被有機(jī)共溶劑所取代, 導(dǎo)致兩相界面處的疏水性能差異發(fā)生變化, 同時(shí)界面張力以及電位差也隨之改變, 從而影響了蛋白質(zhì)的分配4。通常認(rèn)為, 有機(jī)共溶劑對(duì)被分配物質(zhì)分配行為的影響更

11、主要是有機(jī)溶劑和成相高聚物相互作用的結(jié)果5。如在PEG40002Dextran40000體系中分別加入相同量(2% 的乙醇、異丙醇、丙酮, 均使BSA 的分配系數(shù)顯著降低, 且加入乙醇后分配系數(shù)達(dá)到最小。這一現(xiàn)象完全符合以上理論:由于乙醇有較大的水化能, 體系中的水較多地被乙醇所取代, 使兩相界面處的疏水性能差異、界面張力以及電位差較其它有機(jī)溶劑大, 因此蛋白質(zhì)分配系數(shù)的變化較大; 再者乙醇與PEG 相相互作用較強(qiáng), 使得蛋白質(zhì)受排斥而易于向Dext ran 相富集。21313表面活性劑Bodhankar 和Gaikar 等研究了四類表面活性劑, 即陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、非離子表

12、面活性劑和兩性表面活性劑在PEG 2Dext ran 體系中對(duì)物質(zhì)分配的影響。實(shí)驗(yàn)表明, 添加表面活性劑可以改變界面張力、上下相組成等兩相特性, 從而對(duì)物質(zhì)的分配行為進(jìn)行調(diào)節(jié)6。易于同非極性的P 2PEG 結(jié)合, 所以不斷向上相富集8。218親和配基鄭楠等:雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究/2006年第10期9(3 金屬親和雙水相萃取技術(shù)。金屬親和雙水相在聚合物上接上一定的親和配基, 不僅能提高萃取分配的專一性, 而且能增大處理量。例如:NAD H 2PEG 衍生物引入PEG 2Dext ran 體系后使乙醇脫氫酶的分配系數(shù)與其分子上結(jié)合位點(diǎn)數(shù)密切相關(guān); 另Ciba 2cronblue 2P

13、EG 衍生物引入PEG 2Dext ran 體系后使磷萃取和普通親和雙水相萃取相比, 具有親和配基價(jià)廉且再生容易、可用于PEG 2鹽體系的優(yōu)點(diǎn)。Arnold 提出了金屬離子親和雙水相萃取技術(shù), 利用金屬離子和蛋白質(zhì)中精氨酸、組氨酸的親和作用, 以達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。目前金屬離子親和雙水相萃取已應(yīng)用于多種酶的分離純化。影響雙水相萃取的因素比較復(fù)雜, 主要包括靜電作用、疏水作用及界面張力等。通過對(duì)各個(gè)因素的調(diào)節(jié), 可以極大地提高蛋白質(zhì)的選擇性, 達(dá)到向一相富集的目的。參考文獻(xiàn):1曹軍衛(wèi), 馬輝文. 微生物工程M .北京:科學(xué)出版社,2002:2352237.2孫彥. 生物分離工程M .北京:

14、化學(xué)工業(yè)出版社,1998:64.3Gunduz Ufuk , K orkmaz K Bovine serum albumin partitioningin aqueous :Effect of p H and sodium chloride B :BiomedSci Appl , (1+2258.4B Y , Borovskaya A A , Gulaeva N D ,et al. Physico 2chemical features of solvent media in t he phases of aqueous poly 2mer two 2phase systemsJ.Biotech

15、nol Bioeng ,1992,40(1 :127. 5Johansson G , K opperschlager G. Effect s of organic solvent s ont he partitioning of enzymes in aqueous two 2phase systems J .Journal of Chromatography A ,1987,388:2952305.6朱建航. 新型反應(yīng)體系中生物催化合成頭孢氨芐的研究D .上酸果糖激酶的分配系數(shù)成千倍地提高。也可同時(shí)使用以上兩種配基, 從而增加系統(tǒng)的選擇性, 完成多種酶的分離和回收7。3雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)

16、分離純化中的應(yīng)用和展望雙水相萃取技術(shù)已成功地用于分離和提純蛋白質(zhì)、提取抗生素和分離生物粒子、電泳分離氨基酸等方面。雙水相萃取分離技術(shù)還有很多可開拓的領(lǐng)域:(1 新型雙水相體系的開發(fā)。新型雙水相體系主要有兩類:廉價(jià)高聚物/高聚物體系及新型功能雙水相體系。廉價(jià)雙水相體系的開發(fā)目前主要集中在尋找一些廉價(jià)的高聚物取代現(xiàn)用昂貴的高聚物。例如:PP T 的變性淀粉和牌號(hào)為Reppa/以及牌號(hào)為Pulluan 2Dext ran 形成的雙水相體系常相似, 其穩(wěn)定性也比PEG 2鹽雙水相體系更好, 并且具有蛋白質(zhì)溶解度大、粘度小等優(yōu)點(diǎn)10。另外, 特別要提到只有一種成相聚合物的新的雙水相體系, 上相幾乎100

17、%是水, 聚合物絕大部分集中在下相, 該體系不僅操作成本低、萃取效果好, 還為蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)提供了更溫和的環(huán)境11。(2 后續(xù)色譜純化工藝研究。高聚物/高聚物雙水相萃取同離子交換層析技術(shù)結(jié)合可以解決雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)粗分離純化中的工業(yè)化問題。PEG 2鹽體系具有價(jià)廉和分相容易的優(yōu)點(diǎn), 而疏水色譜可在高鹽濃度下操作, 故PEG 2鹽體系與疏水色譜的結(jié)合有很大的發(fā)展空間。如Schutte 已成功利用疏水色譜從鹽相中分離純化蛋白質(zhì)。海:華東理工大學(xué),2002:46.7嚴(yán)?？? 生化分離工程M .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001:1772179.8Albert sson P A. Partitio

18、n of Cell Particles and Macromolecules(3rd ed M .New Y ork :JohnWilley , 1986:84288.9陸強(qiáng), 鄧修. 提取與分離天然產(chǎn)物中有效成分的新方法雙水相萃取技術(shù)J.中成藥,2000,22(9 :6532655.10譚平華, 林金清, 肖春妹, 等. 雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用J.化工生產(chǎn)與技術(shù),2003,10(1 :19222.11Johansson Hans 2Olof ,Josefine P , Tjerneld Folke. Thermosepa 2rating water/polymer system :Anovel one 2polymer aqueous two 2phase system for protein purification J .Biotechnol Bioeng , 1999,66(4 :2472257.Study on Partition and