核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題ppt課件

1、q 基因組基因組DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它qCTABCTAB法原理植物法原理植物DNADNA提取經(jīng)典提取經(jīng)典方法方法CTABhexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸構(gòu)成復(fù)合溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸構(gòu)成復(fù)合物。物。該復(fù)合物在高鹽溶液中該復(fù)合物在高鹽溶液中0.7mol/L NaCl是可溶的，經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑是可溶的，經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后參與乙醇沉淀即可使核酸分別抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后參與乙醇沉淀即可使核

2、酸分別出來(lái)。出來(lái)。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 時(shí)會(huì)構(gòu)成沉淀析出，因此在將其參與冰冷的時(shí)會(huì)構(gòu)成沉淀析出，因此在將其參與冰冷的 植物資料之前必需預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于植物資料之前必需預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。qCTABCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份組份 Tris-HCl pH8.0EDTA pH8.0 NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%V/V運(yùn)用前參與運(yùn)用前參與Tris-HCl pH8.0提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合螯合Mg2

3、+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分別；溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分別；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，防止褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，防止褐變，使酚容易去除qCTABCTAB提取緩沖液的改良配方提取緩沖液的改良配方 組份組份 Tris-HCl pH8.0EDTA pH8.0NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W

4、/V)5%(W/V)2%V/V運(yùn)用前參與運(yùn)用前參與vPVP聚乙烯吡咯烷酮是酚的絡(luò)合物，能與多酚構(gòu)成一種不溶聚乙烯吡咯烷酮是酚的絡(luò)合物，能與多酚構(gòu)成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。和多糖結(jié)合，有效去除多糖。q SDS SDS法原理法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫是一種陰離子去垢劑，在高溫5565條件下能裂解細(xì)條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度冰浴，使蛋白質(zhì)及多糖濃度并降低

5、溫度冰浴，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris-HCl pH8.0EDTA pH 8.0 NaCl SDS終濃度終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS SDS法法DNADNA提取緩沖液提取緩沖液 物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法 化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式：酶法生物方式：酶法q根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞

6、裂解方式的不同有：吸附資料結(jié)合法：吸附資料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分別純化方式的不同有：根據(jù)核酸分別純化方式的不同有：硅質(zhì)資料硅質(zhì)資料陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫?？旖莞咝А？旖莞咝?。低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而到達(dá)分別目的。物，從而到達(dá)分別目的。濃鹽法：濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RN

7、P和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分別在鹽溶液中溶解度不同，將二者分別有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分別各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分別各種內(nèi)容物q堿裂解法原理堿裂解法原理 染色體染色體DNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNA為線為線狀分子，而質(zhì)粒狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處置當(dāng)用堿處置DNA溶液時(shí)，線狀染色體溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性在回到中性

8、pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合構(gòu)成片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合構(gòu)成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子那么以溶解形狀存分子那么以溶解形狀存在液相中，從而可經(jīng)過(guò)離心將兩者分開(kāi)。在液相中，從而可經(jīng)過(guò)離心將兩者分開(kāi)。q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體對(duì)數(shù)期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀枯燥溶解枯燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液q煮沸法原理煮沸法原理 染色體染色體DNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色

9、體分子大得多，且染色體DNA為線為線狀分子，而質(zhì)粒狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處置當(dāng)加熱處置DNA溶液時(shí)，線狀染色體溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合構(gòu)成片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合構(gòu)成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子那么以溶解形狀存分子那么以溶解形狀存在液相中，從而可經(jīng)過(guò)離心將兩者分開(kāi)。在液相中，從而可經(jīng)過(guò)離心將兩者分開(kāi)。q差速離心法原理差速離心法原理 是利用物質(zhì)比

10、重的不同分別混合物的一種方法。是利用物質(zhì)比重的不同分別混合物的一種方法。 將待分別物質(zhì)置于均勻介質(zhì)蔗糖中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)將待分別物質(zhì)置于均勻介質(zhì)蔗糖中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)展離心，比艱苦的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，展離心，比艱苦的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分別。從而得以分別。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，本身可編碼蛋線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，本身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因此在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度白，它們的比重和大小一定，因此在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心

11、法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分別出來(lái)。種組分分級(jí)分別出來(lái)。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、提取常見(jiàn)問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策緣由分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見(jiàn)常見(jiàn) 問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策第二部分：第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、提取常見(jiàn)問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策緣由分析及其對(duì)策I.I.資料預(yù)備資料預(yù)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分別、純化核酸分別、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并

12、去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中最好運(yùn)用新穎資料，低溫保最好運(yùn)用新穎資料，低溫保管的樣品資料不要反復(fù)凍融管的樣品資料不要反復(fù)凍融提取血液基因組提取血液基因組DNA時(shí)，要時(shí)，要選擇有核細(xì)胞白細(xì)胞選擇有核細(xì)胞白細(xì)胞組培細(xì)胞培育時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，組培細(xì)胞培育時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否那么會(huì)呵斥否那么會(huì)呵斥DNA降解降解含病毒的液體資料含病毒的液體資料DNA含量含量較少，提取前先富集較少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取運(yùn)用途于對(duì)數(shù)期的新穎菌體運(yùn)用途于對(duì)數(shù)期的新穎菌體老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒添加老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)

13、質(zhì)粒添加培育時(shí)應(yīng)參與挑選壓力，否那培育時(shí)應(yīng)參與挑選壓力，否那么菌體易污染，質(zhì)粒易喪失么菌體易污染，質(zhì)粒易喪失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，那么應(yīng)加大低拷貝或大質(zhì)粒，那么應(yīng)加大菌體用量菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接質(zhì)粒喪失菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接質(zhì)粒喪失資料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，資料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，純度低針對(duì)不同資料，選擇適當(dāng)?shù)牧厌槍?duì)不同資料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處置方式：解預(yù)處置方式：植物資料液氮研磨植物資料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃

14、珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取菌體量適當(dāng)菌體量適當(dāng)培育基去除干凈，同時(shí)保證菌培育基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)5分鐘，分鐘，否那么質(zhì)粒易被打斷否那么質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否那么復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否那么會(huì)有基因組會(huì)有基因組DNA的污染的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處置，以破壁用酶法或機(jī)械法處置，以破壁采用吸附資料吸附的方式分別采用吸附資料吸附的方式分別DNA時(shí)，應(yīng)提供相時(shí)，

15、應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)酚采用有機(jī)酚/氯仿抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作氯仿抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔要輕柔離心分別兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心分別兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同資料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的針對(duì)不同資料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法去雜質(zhì)的方法基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除：q 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提q 運(yùn)用變性劑變性運(yùn)用變性劑變性SDSSDS、異硫、異硫氰酸胍等氰酸胍等q 高鹽洗滌高鹽洗滌q 蛋白酶處置蛋白酶處置q 多糖的去除：多糖的去除：q 高鹽法：用乙醇沉

16、淀時(shí)，在待沉淀溶液高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中參與中參與1/21/2體積的體積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解，高鹽可溶解多糖。多糖。q 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。q 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體體積積) )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖而去除多糖 。q 用用PEG8000PEG8000替代乙醇沉淀替代乙醇沉淀DNADNA：在：在500L 500L DNADNA液中參與液中參與200l 20% PEG8000 (200l 20% PEG8000 (含含1.2 M NaC

17、l) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除：q 在抽提液中參與防止酚類氧化的試劑：在抽提液中參與防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等硫蘇糖醇等q 參與易與酚類結(jié)合的試劑：如參與易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除：q 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙

18、醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分淀會(huì)更充分沉淀時(shí)參與沉淀時(shí)參與1/10體積的體積的NaAcpH5.2，3M，有利于，有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后運(yùn)用沉淀后運(yùn)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)不要過(guò)分枯燥，讓乙醇充分揮發(fā)不要過(guò)分枯燥假設(shè)長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議運(yùn)用假設(shè)長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議運(yùn)用TE緩沖液溶解緩沖液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNasepH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚

19、類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響后續(xù)酶解反響DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質(zhì)詳細(xì)方法見(jiàn)前質(zhì)詳細(xì)方法見(jiàn)前重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)添加添加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數(shù)次數(shù)2-32-3次次q問(wèn)題一：?jiǎn)栴}一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反反響。響。 緣由緣由對(duì)對(duì)策策資料不新穎或反復(fù)凍資料不新穎或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性

20、提取過(guò)程操作過(guò)于猛提取過(guò)程操作過(guò)于猛烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新穎資料，低溫保管資料防盡量取新穎資料，低溫保管資料防止反復(fù)凍融止反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前參與裂解緩沖液前參與裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的資料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的資料的的DNADNA時(shí)，可添加裂解液中螯合劑時(shí)，可添加裂解液中螯合劑的含量的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔一切試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高一切試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保管于緩沖液中，防止

21、分裝保管于緩沖液中，防止反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問(wèn)題二：?jiǎn)栴}二：DNADNA降解。降解。對(duì)對(duì)策策 緣由緣由實(shí)驗(yàn)資料不佳或量少實(shí)驗(yàn)資料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗滌時(shí)洗滌時(shí)DNADNA喪失喪失盡量選用新穎幼嫩的資盡量選用新穎幼嫩的資料料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延伸高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延伸對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可添對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可添加加PKPK的用量的用量低溫沉淀，延伸沉淀時(shí)間低溫沉淀，延伸沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用

22、槍頭將洗滌洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問(wèn)題三：?jiǎn)栴}三：DNADNA提取量少。提取量少。對(duì)對(duì)策策 緣由緣由第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、提取常見(jiàn)問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策緣由分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見(jiàn)常見(jiàn) 問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理： 細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體細(xì)胞在變性劑

23、異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；上的蛋白變性，核酸釋放； 釋放出來(lái)的釋放出來(lái)的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分別；分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分別； 有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純真有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純真RNARNA。 q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步驟步驟: : 資料預(yù)備：盡量新穎。資料預(yù)備：盡量新穎。 裂解變性：異硫氰酸胍亞硫氫胍，巰基乙醇，裂解變性：異硫氰酸胍亞硫氫胍，巰基乙醇，N-N-月桂肌月桂肌氨酸等。氨酸等。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)

24、合物變性，釋放使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNARNA，有效，有效抑制核酸酶。抑制核酸酶。 純化分別：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚純化分別：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除氯仿可抽提去除雜物。雜物。 洗滌：洗滌：7070乙醇。乙醇。 沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。 乙酸鈉乙酸鈉pH4.0pH4.0：維持變性的細(xì)胞裂解液的：維持變性的細(xì)胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNARNA。q 資料：資料：q 新穎，切忌運(yùn)用反復(fù)凍融的資料新穎，切忌運(yùn)用反復(fù)凍融的資料q 如假設(shè)資料來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需求一定的如假設(shè)資

25、料來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需求一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘①Y料儲(chǔ)存在時(shí)間間隔?？梢韵葘①Y料儲(chǔ)存在TRIzolTRIzol或或樣品儲(chǔ)存液中，于樣品儲(chǔ)存液中，于7070或或2020保管保管q 如要多次提取，請(qǐng)分成多份保管如要多次提取，請(qǐng)分成多份保管q 液氮長(zhǎng)期保管，液氮長(zhǎng)期保管，7070短期保管短期保管q 樣品破碎及裂解：樣品破碎及裂解：q 根據(jù)不同資料選擇不同的處置方法：根據(jù)不同資料選擇不同的處置方法：q 培育細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀馀嘤?xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀鈗 酵母和細(xì)菌：普通酵母和細(xì)菌：普通TRIzolTRIzol可直接裂解，對(duì)可直接裂解，對(duì)于一些特殊的資料可先用酶或者機(jī)械方法于一些特殊的資料

26、可先用酶或者機(jī)械方法破壁破壁q 動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品堅(jiān)持冷凍解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品堅(jiān)持冷凍q 樣品量適當(dāng)，保證充分裂解樣品量適當(dāng)，保證充分裂解q 為減少為減少DNADNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量用量q 純化：純化：q 在運(yùn)用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻在運(yùn)用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；，且動(dòng)作快速；q 經(jīng)典的純化方法，如經(jīng)典的純化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，雖然沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易呵斥經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易呵斥 RNA RNA 降解降解；q

27、 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響去除影響 RNA RNA 后續(xù)酶反響的雜質(zhì)，是目后續(xù)酶反響的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。前較為理想的選擇。第一部分：第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第二部分：第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、提取常見(jiàn)問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策緣由分析及其對(duì)策內(nèi)容內(nèi)容第三部分：第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介提取方法簡(jiǎn)介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見(jiàn)常見(jiàn) 問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常見(jiàn)常見(jiàn) 問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策問(wèn)題、緣由分析及其對(duì)策q

28、 RNA RNA 的降解的降解 q OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳下游實(shí)驗(yàn)效果不佳q 新穎細(xì)胞或組織：新穎細(xì)胞或組織：q 裂解液的質(zhì)量裂解液的質(zhì)量q 外源外源RNaseRNase的污染的污染q 裂解液的用量缺乏裂解液的用量缺乏q 組織裂解不充分組織裂解不充分q 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 ( (如脾臟，胸腺如脾臟，胸腺等等) )，很難防止，很難防止 RNA RNA 的降解。的降解。q 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)運(yùn)用更多裂解液。時(shí)運(yùn)用更多裂解

29、液。q 冷凍樣品：冷凍樣品：q 樣品取材后應(yīng)立刻置于液氮中速凍，樣品取材后應(yīng)立刻置于液氮中速凍，然后可以移至然后可以移至-70-70冰箱保管。樣品要冰箱保管。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；相對(duì)小一點(diǎn)；q 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；q 樣品與裂解液充分接觸前防止融化，樣品與裂解液充分接觸前防止融化，研磨器具必需預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)研磨器具必需預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。補(bǔ)充液氮。OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值比值偏低偏低q 蛋白質(zhì)污染：q 不要吸入中間層及有機(jī)相，參與氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。q 減少起始樣品量，確保裂解完

30、全、徹底q 處理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚殘留：q 不要吸入中間層及有機(jī)相，參與氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。q 處理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值比值偏低偏低q 抽提試劑殘留：抽提試劑殘留：q 確保洗滌時(shí)要徹底懸浮確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 RNARNA，并且徹底去掉，并且徹底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。q 處理方法處理方法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 設(shè)備限制：設(shè)備限制：q 測(cè)定測(cè)定OD260 OD260 及及OD280 OD280 數(shù)值時(shí)，要使數(shù)值時(shí)，要使OD260 OD2

31、60 讀數(shù)在讀數(shù)在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之間。此范圍線之間。此范圍線性最好。性最好。q 用水稀釋樣品：用水稀釋樣品：q 測(cè)測(cè) OD OD 時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)運(yùn)用時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)運(yùn)用 10 mM 10 mM TrisTris，pH 7.5pH 7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。的降低。 q 非變性電泳：非變性電泳：q 上樣量超越上樣量超越 3ug3ug，電壓超越，電壓超越 6V/cm6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均能夠?qū)е码娪揪彌_液陳舊，均能夠?qū)е?28S 28S 和和 18S 18S 條帶分不開(kāi)。條帶分不開(kāi)。q 變性電泳條帶變

32、淡：變性電泳條帶變淡：q EB EB 與單鏈的結(jié)合才干要差一些，故同與單鏈的結(jié)合才干要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；淡一些；q 甲醛的質(zhì)量不高甲醛的質(zhì)量不高 。q RNA 降解 q 抽提試劑的殘留 q 75% 乙醇洗滌 q 樣品中雜質(zhì)的殘留q 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 q DNA 污染 q 運(yùn)用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA RTRT常見(jiàn)問(wèn)題分析和處理方案常見(jiàn)問(wèn)題分析和處理方案問(wèn)題一：少量或沒(méi)有問(wèn)題一：少量或沒(méi)有RT-PCRRT-PCR產(chǎn)物產(chǎn)物RNARNA降解降解分別無(wú)污染，高質(zhì)量的分別無(wú)污染，高質(zhì)量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑7070v/vv/v乙醇清洗乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制劑沉淀，除去抑制劑起始起始RNARNA量太低量太低添加添