艾滋檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用

1、酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用:艾滋病病毒抗體檢測(cè)是診斷 HIV 感染的常規(guī)方法。隨著 HIV 抗體檢測(cè)工作需求的擴(kuò)大，除了經(jīng)典的雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)以外，快速檢測(cè)試劑以其操作方便快捷也得到了日益廣泛的使用。酶聯(lián)免疫法，簡稱 ELISA。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。步驟：ELISA 用血清來檢測(cè)，首先血液要經(jīng)過至少半個(gè)小時(shí)的凝集，然后取血清(這是有些網(wǎng)友不理解為什么抽完了血對(duì)血置之不理的原因，其實(shí)是誤會(huì))。將酶復(fù)合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性、陽性對(duì)照，還有就是質(zhì)控品(這是嚴(yán)格的要求，它的范圍必須在質(zhì)控范圍內(nèi))。經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的孵育，然后洗板，加底物，半個(gè)小時(shí)避光反應(yīng)

2、后加終止液即完成反應(yīng)部分，然后就是讀數(shù)。由數(shù)值來判斷結(jié)果的陰性或陽性。這條魚明天可要你來殺哦，我知道小舅媽是不殺生的！回家后基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根

3、據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。這條魚明天可要你來殺哦，我知道小舅媽是不殺生的！回家后酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用:ELISA 可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有 3 種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。具體方法有：(一)雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一

4、段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體這條魚明天可要你來殺哦，我知道小舅媽是不殺生的！回家后結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。(二)雙位點(diǎn)一步法在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分這條魚明天可要你來殺哦，我知道

5、小舅媽是不殺生的！回家后別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的 ELISA 提高到新水平。在一步法測(cè)定中，酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。(三)間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：這條魚明天可要你來殺哦，我知道小舅媽是不殺生的！回家后(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。(3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病