應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用ppt課件

1、應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用作用 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心王瑞剛實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)原理 氨基酸分子上的氨基轉(zhuǎn)移到-酮酸分子上的反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用 . 轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸的重要反應(yīng)之一，由轉(zhuǎn)氨酶催化.經(jīng)轉(zhuǎn)氨基后,原 來的氨基酸變成了酮酸，原來的酮酸變成相應(yīng)的氨基酸。 紙層析是以濾紙作支持物，用一定的溶劑系統(tǒng)展開，使混合樣品 達(dá)到分離分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中， 點(diǎn)樣在濾紙的一端；再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點(diǎn)樣的一端通過毛細(xì) 現(xiàn)象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當(dāng)?shù)娘@ 色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖

2、譜。樣品經(jīng)展開后其一物質(zhì)在紙層 析譜上的位置常用比移值Rf來表示。原點(diǎn)至溶劑前沿的距離點(diǎn)的距離原點(diǎn)至紙層析斑點(diǎn)中心Rf = 紙層析可看作是溶質(zhì)樣品在固定相與流動(dòng)相之間的連續(xù)抽 提，由于溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。一定的物質(zhì)在 兩相間有固定的分配系數(shù)，因而在恒定條件液劑、PH、溫度） 下，各物質(zhì)有固定的Rf值，據(jù)此可達(dá)到分析鑒定的目的。 由于濾紙纖維可吸收2025%的水分；且其中67%以氫鍵形式 與纖維素上羥基結(jié)合，一般條件下難脫去；所以紙層析實(shí)際上是以水 相作固定相，展開的溶劑作流動(dòng)相。 紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基 酸分離一般用上行法。上行法又分單向成

3、分較為簡單的樣品和雙 向單向時(shí)斑點(diǎn)重疊分離不開，于是在其垂直方向用另一種溶劑系統(tǒng)展層）。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。實(shí)驗(yàn)試劑10.01M pH7.4 磷酸緩沖液：0.2 M Na2HPO4溶液81ml與0.2M NaH2PO4 溶液19ml混勻，加蒸餾水稀釋 20倍。20.1M L-丙氨酸：稱取0.891g L-丙氨酸如DL丙氨酸用量加倍），用 少量0.01 M pH7.4 磷酸緩沖液溶解，以NaOH溶液 小心調(diào)pH至7.4，再用磷酸緩沖液定容到100ml。30.1M L-谷氨酸：稱取1.47 g谷氨酸如上法配成100 ml溶液。 40.1M L-酮戊二酸：稱取1.46 g-酮戊二酸如上

4、法配成100 ml溶 液。5層析溶劑 ：用水飽和的苯酚。用新蒸餾的苯酚2份，加蒸餾水1份 (V/V)，放入分液漏斗中劇烈搖動(dòng)后，在暗處靜置若干時(shí) 間7-10小時(shí)），待分層后，取下層清液備用。貯于棕色 瓶中暗處保存。60.1%（W/V茚三酮實(shí)驗(yàn)步驟1肉糜制備：稱取新鮮豬肝5克在低溫下剪碎，用研缽研磨 成糊狀備用。2酶促反應(yīng) 按表次序在2支試管中加入試劑。管號(hào)試劑對(duì)照管測定管0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/L-酮戊二酸(ml)0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液(ml)肉糜（g）1.01.01.01.01.01.01.01.0 對(duì)照管當(dāng)肉糜加入后立即煮沸l(wèi)0min，而后放人37 水浴

5、中與測定管同時(shí)保溫，測定管加入肌肉糜后放人37 水浴中保溫lh，然后于沸水浴中加熱10min終止反應(yīng)。冷 卻后將二管分別靜置以備層析用。 3層析： 取直徑10-llcm圓形層析濾紙已打孔一張， 通過圓心作一直徑為2cm的圓，在圓周上分別取4等距點(diǎn) 分別作測定管和對(duì)照管溶液及標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸、谷氨酸的點(diǎn) 樣位置，點(diǎn)樣時(shí)，將蘸水筆使用前應(yīng)放在酒精燈上燒 紅，冷卻，對(duì)應(yīng)溶液只能用對(duì)應(yīng)的筆點(diǎn)樣輕輕靠到濾 紙上(不能損傷濾紙)，使斑點(diǎn)直徑為2-3 mm (不能超過 5mm)。為了有足夠量的樣品點(diǎn)在濾紙上，每種樣品應(yīng) 重復(fù)點(diǎn)3-4次，每次點(diǎn)樣后待自然風(fēng)干，再點(diǎn)下一次。 另取一濾紙小條將其下端剪成刷狀，卷成“燈芯插人中心 小孔處，使“燈芯不突出紙面(少許突出紙面亦可)。然后將 該層析圓濾紙平放在盛有水飽和酚的康維皿上，紙芯下端 須狀部分浸人溶液中，再在層析濾紙上罩一個(gè)大小合適的 表面皿，溶劑沿紙芯上升到濾紙，再向四周擴(kuò)散，待溶劑 前沿到達(dá)距康維皿邊緣0.5-lcm處時(shí) (約lh左右)，取出層析 濾紙，去掉紙芯，記下溶劑前沿，在電爐子上烘干以除去 酚溶劑。