實(shí)驗(yàn)十一 Southern雜交分析

1、11.植物基因組植物基因組DNA的的Southern雜雜交交1、植物基因組DNA的提取與純化2、植物基因組DNA的酶切3、酶切基因組DNA的凝膠電泳和Southern blotting4、探針序列的獲得與標(biāo)記5、探針與基因組DNA的雜交6、雜交信號(hào)的檢測(cè)主要步驟主要步驟一、一、Southern blotting（變性（變性DNA轉(zhuǎn)移到膜上）轉(zhuǎn)移到膜上）鹽轉(zhuǎn)：鹽轉(zhuǎn)：20SSC為轉(zhuǎn)移液，轉(zhuǎn)移后為轉(zhuǎn)移液，轉(zhuǎn)移后DNA不能與尼龍膜共價(jià)結(jié)合，需要紫外交聯(lián)。不能與尼龍膜共價(jià)結(jié)合，需要紫外交聯(lián)。堿轉(zhuǎn)：堿轉(zhuǎn)：0.4M NaOH為轉(zhuǎn)移液，轉(zhuǎn)移后的為轉(zhuǎn)移液，轉(zhuǎn)移后的DNA可直接與帶正電荷的尼龍膜共價(jià)結(jié)合?？芍苯优c

2、帶正電荷的尼龍膜共價(jià)結(jié)合。帶正電荷的尼龍膜帶正電荷的尼龍膜分子量大于分子量大于8kb的的DNA分子，從凝膠轉(zhuǎn)移到分子，從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上的效率很低，所以需要把大片段膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打打斷成較小的片段，以方便轉(zhuǎn)移。斷成較小的片段，以方便轉(zhuǎn)移。l 紫外線照射打斷大分子量紫外線照射打斷大分子量DNAl 利用脫嘌呤方法打斷利用脫嘌呤方法打斷DNA分子分子注：所有操作均需帶手套進(jìn)行！注：所有操作均需帶手套進(jìn)行！脫嘌呤方法的溶液配方及實(shí)驗(yàn)步驟脫嘌呤方法的溶液配方及實(shí)驗(yàn)步驟脫嘌呤液脫嘌呤液中和液中和液變性液變性液0.25M HCl0.5M NaOH1.5M NaCl0.5M Tris-H

3、Cl1.5M NaClPH 7.5標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽緩沖液標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽緩沖液（pH 7.0）0.3M 檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉 3M NaCl酶切基因組酶切基因組DNA的凝膠電泳的凝膠電泳1、配制0.8%或者1.0%的瓊脂糖凝膠，注意膠的厚度和膠孔大小是否合適，在能滿足需要的情況下，膠濃度越低、膠越薄越好。2、點(diǎn)樣，基因組DNA酶切電泳一般用/HindIII作為DNA分子量標(biāo)記。建議干點(diǎn)，即先加入與凝膠持平的新的電泳緩沖液，使膠孔里沒有液體是點(diǎn)樣，之后電泳至樣品遷移出膠孔后添加電泳緩沖液至高于凝膠液面1-2mm。3、電泳：先用高電壓使樣品遷移出膠孔，再改用低電壓（1-1.5V/cm）低電壓過夜，至溴酚藍(lán)

4、到達(dá)凝膠下部1.5-2cm時(shí)停止電泳。4、凝膠照相，注意紫外照射時(shí)間越短越好；然后對(duì)凝膠進(jìn)行修整，切去膠孔和邊緣不含DNA的部分，注意保持邊緣齊整，在凝膠正面的右上角切掉一小塊以示方向，之后用記錄凝膠的長和寬；凝膠處理過程中準(zhǔn)備一塊與凝膠相同大小的尼龍膜和兩張濾紙，在尼龍膜的右上角剪掉一小塊以示方向，如有需要，用鉛筆在右下角寫好編號(hào)。瓊脂糖凝膠的處理瓊脂糖凝膠的處理1、若使用堿轉(zhuǎn)法，可以直接將凝膠中大于8kb的部分置于紫外燈下照射10-15分鐘后用于轉(zhuǎn)膜 。2、若使用鹽轉(zhuǎn)法，則按照脫嘌呤步驟進(jìn)行凝膠的處理。鹽轉(zhuǎn)法脫嘌呤步驟鹽轉(zhuǎn)法脫嘌呤步驟1、用0.25M的HCl室溫漂洗凝膠至溴酚藍(lán)的藍(lán)色變成黃

5、色（約15min），50rpm；2、用滅菌的雙蒸水洗掉凝膠表面的HCL溶液，漂洗5min；3、用變性液室溫漂洗凝膠兩次，每次15min，50rpm（使DNA變性），之后用蒸餾水漂洗凝膠；4、用中和液室溫漂洗凝膠兩次，每次15min，50rpm，之后用蒸餾水漂洗；5、在20SSC中平衡凝膠10min，等待轉(zhuǎn)膜。6、剪好的膜先用滅菌的蒸餾水潤濕（膜漂浮在液面上），然后在2SSC中平衡（膜可以沒入溶液中）。濾紙用2SSC潤濕。濾紙橋?yàn)V紙橋凝膠凝膠尼龍膜尼龍膜吸水紙吸水紙重物重物支撐架支撐架濾紙濾紙轉(zhuǎn)移液轉(zhuǎn)移液毛細(xì)管轉(zhuǎn)移毛細(xì)管轉(zhuǎn)移Southern轉(zhuǎn)膜過程轉(zhuǎn)膜過程1、找一塊比凝膠大的平臺(tái)（如大型的制膠板

6、），放入適當(dāng)?shù)耐斜P中，加入20SSC轉(zhuǎn)移液。2、平臺(tái)上鋪一層比凝膠稍大的用20SSC浸透的厚濾紙或2-3層普通濾紙，濾紙兩頭接觸到托盤中的20SSC溶液。濾紙和平臺(tái)之間不能有氣泡。濾紙和平臺(tái)之間不能有氣泡。 。3、將凝膠正向放于平臺(tái)上濕潤的濾紙中央，濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。4、用保鮮膜圍繞凝膠周邊，但不要覆蓋凝膠，以此作為屏障，防止液體自液池直接流至凝膠上方的紙巾層中（液流“短路短路”現(xiàn)象是導(dǎo)致凝膠中的DNA的轉(zhuǎn)移效率下降的主要原因）。5、切一疊（5-8 cm高）與濾紙同等大小的紙巾，將其放置在濾紙的上方，并在上方放一塊玻璃板，玻璃板上壓重物，使DNA轉(zhuǎn)移持續(xù)過夜（可轉(zhuǎn)移5-8小時(shí)）。6、

7、轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和濾紙，將濕潤的尼龍膜直接進(jìn)行紫外交聯(lián)固定DNA到尼龍膜上。對(duì)轉(zhuǎn)移后的凝膠，可在紫外透射儀上觀察是否還有殘留的DNA。轉(zhuǎn)移方法和膜注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)移方法和膜注意事項(xiàng)：1、凝膠電泳的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，膠的變性和中和均參照參考文獻(xiàn)中Sambrook等的文章。膠中不加入EB會(huì)更好，因?yàn)镋B可能引起背景不均勻的問題，EB也可以加入到樣品中。2、所有普通類型的DNA轉(zhuǎn)移方法都適用于后續(xù)的地高辛雜交實(shí)驗(yàn)。3、根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，用20SSC采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)印的方法使DNA轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼龍膜上可以獲得最好的結(jié)果。4、堿性轉(zhuǎn)移（如在0.4M NaOH中）不適用于地高辛標(biāo)記分子量marker

8、的轉(zhuǎn)移。DNADNA的轉(zhuǎn)移和固定的轉(zhuǎn)移和固定如果你想采用如果你想采用那么那么紫外交聯(lián)的紫外交聯(lián)的方法方法（尼龍膜）尼龍膜）將將剛轉(zhuǎn)好的濕潤的尼龍剛轉(zhuǎn)好的濕潤的尼龍膜膜DNA面向上面向上放到放到保鮮膜上保鮮膜上。用用紫外紫外交聯(lián)交聯(lián)儀交聯(lián)儀交聯(lián)這這塊濕潤的塊濕潤的膜膜，DNA面向上面向上。紫外交聯(lián)后，將膜放入雙蒸水中簡(jiǎn)單沖洗一下，然后紫外交聯(lián)后，將膜放入雙蒸水中簡(jiǎn)單沖洗一下，然后自然自然晾干晾干后保存，也可以直接進(jìn)入預(yù)雜交步驟后保存，也可以直接進(jìn)入預(yù)雜交步驟。，烘烤（尼龍膜）在2SSC簡(jiǎn)單的洗滌一下膜將尼龍膜放在120下烘烤30分鐘或者根據(jù)操作說明的要求進(jìn)行操作。，烘烤（尼龍膜）在2SSC簡(jiǎn)單的

9、洗滌一下膜將尼龍膜放在80下真空烘烤2小時(shí)固定操作固定操作：將DNA固定到膜上可以通過下面的任何一種操作：如果如果那么那么你想繼續(xù)實(shí)驗(yàn)立即將這個(gè)膜進(jìn)行預(yù)雜交如果你想稍后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)敲磳⑼耆稍锏哪び脼V紙或者保鮮膜包裹后儲(chǔ)存于2-8膜的儲(chǔ)存膜的儲(chǔ)存：請(qǐng)根據(jù)下表選擇膜的儲(chǔ)存方法。二、探針標(biāo)記和檢測(cè)二、探針標(biāo)記和檢測(cè)此試劑盒采用此試劑盒采用DIG（地高辛地高辛），一種甾類半抗原，一種甾類半抗原（steroid hapten）去標(biāo)記去標(biāo)記DNA探針用于雜交和后續(xù)的免疫檢測(cè)。探針用于雜交和后續(xù)的免疫檢測(cè)。操作程序操作程序儀器設(shè)備儀器設(shè)備試劑試劑DIG-DNA標(biāo)記水浴滅菌的雙蒸水pH8.0 滅菌的EDTA標(biāo)

10、記效率的半定量帶正電荷的尼龍膜*地高辛洗滌和封阻緩沖組合*或者TE緩沖液洗滌緩沖液；馬來酸緩沖液檢測(cè)緩沖液；TE緩沖液DNA轉(zhuǎn)移和固定紫外光盒或者商業(yè)化可用于紫外交聯(lián)的其他設(shè)備2SSC或者20SSC雜交尼龍膜，帶正電荷雜交袋或雜交管， 注意：當(dāng)用地高辛雜交緩沖液工作時(shí)，不要用開口的托盤。免疫檢測(cè)耐熱的塑料袋或者滾筒瓶雜交袋*合適體積的容器用于雜交地高辛洗滌和封阻緩沖液組合*，或者TE緩沖液洗滌緩沖液；馬來酸緩沖液檢測(cè)緩沖液；TE緩沖液DNA 斑點(diǎn)的脫色和重新標(biāo)記探針大的托盤水浴10SSC；10%SDS；NaOH附加儀器與所需試劑附加儀器與所需試劑DIG-High Prime labeled p

11、robes can be used in northern, Southern-, and dot-blot analysis, as well as colony and plaque hybridizations. This kit offers random-primed labeling of DNA templates with DIG-11-dUTP, alkali-labile, and chemiluminescent detection of the DIG-labeled hybrids. This kit was assembled with convenience in

12、 mind, offering ready-to-use CSPD supplied with a dripping device for easy application, ready-made blocking solution, and DIG Easy Hyb granules. The DIG-High Prime mixture includes stabilized Klenow enzyme, nucleotides, primers, and reaction buffer, all in one convenient reagent. ApplicationSensitiv

13、ity and specificity: Standard assay uses 1 g of linearized pBR328. It is usual to expect 0.8 g labeled DNA after 1 h of labeling, and 2.3 g labeled DNA after 20 h reaction. In a dot blot hybridization, 0.03 pg of homologous DNA is detectable with chemiluminescence (probe concentrations at 20 ng/ml).

14、 A single copy human gene (t-PA) is detectable in a Southern blot, loading 1 g of digested placenta DNA. Product Description1. DIG-High Prime, 5x conc., 50 l （用于探針標(biāo)記）（用于探針標(biāo)記）2. DIG-labeled Control DNA, 20 l, (5 g/ml) pBR328 (linearized with Bam HI) （用于估測(cè)探針產(chǎn)量）（用于估測(cè)探針產(chǎn)量）3. DNA Dilution Buffer, 3 x 1 m

15、l （用于估測(cè)探針產(chǎn)量）（用于估測(cè)探針產(chǎn)量）4. Anti-digoxigenin-AP Conjugate, 50 l （化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針（化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針-靶序列雜交）靶序列雜交）5. CSPD, ready-to-use, 50 ml （化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針（化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針-靶序列雜交）靶序列雜交）6. Blocking Solution, 10 x conc., 4 x 100 ml （化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針（化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針-靶序列雜交）靶序列雜交）7. DIG Easy Hyb Granules, 4 x 100 ml （用于探針與膜的雜交）（用于探針與膜的雜交）Kit Contents用

16、用20SSC采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)印的方法使采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)印的方法使DNA轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼龍膜轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼龍膜上可以獲得最好的結(jié)果。上可以獲得最好的結(jié)果。步驟步驟操作操作1向一個(gè)反應(yīng)管仲中加入1g模板模板DNA（線性或超螺旋）和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達(dá)16L。2沸水浴10分鐘以變性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全變性對(duì)于標(biāo)記的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-High Prime（1號(hào)管），并取4L加入到變性DNA中，混合并簡(jiǎn)單離心。孵育1小時(shí)或者過夜。注意：較長的孵育時(shí)間（最高達(dá)20小時(shí)）能夠提高地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量。4加入2 L 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/

17、或 65加熱10分鐘終止反應(yīng)。注意：采用地高辛高效引物獲得的地高辛標(biāo)記片段的長度范圍可以從200 bp到1000 bp甚至更長，這主要取決于原始模板DNA的長度。1、探針標(biāo)記與標(biāo)記效率的檢測(cè)、探針標(biāo)記與標(biāo)記效率的檢測(cè)雜交工作溶液的制備雜交工作溶液的制備分兩次小心的將64mL無菌雙蒸水加入到地高辛雜交顆粒瓶（7號(hào)瓶）中，然后立即在37條件下攪拌5分鐘進(jìn)行溶解。雜交溫度雜交溫度適宜的雜交溫度是根據(jù)GC含量和探針與靶片段的相似百分?jǐn)?shù)計(jì)算獲得的，具體的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) I=能夠雜交上的片段的長度，以堿基對(duì)進(jìn)行計(jì)算Topt.= Tm -（2025）這一給

18、出數(shù)字的方程式是根據(jù)雜交溶液中含有50%甲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)方程式計(jì)算得到的。用于地高辛雜交液進(jìn)行雜交的實(shí)際雜交溫度Topt. 要比計(jì)算出的Tm低20-25。Topt. 可以作為一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交溫度，允許探針和靶序列之間有18%的錯(cuò)配。當(dāng)你的探針與靶序列的相似度低于80%時(shí)，你應(yīng)該相應(yīng)的降低Topt（大約每1%的錯(cuò)配要降低1.4），同時(shí)相應(yīng)的調(diào)整嚴(yán)謹(jǐn)洗滌步驟（即提高SSC濃度和降低洗滌溫度）。步驟步驟操作操作1將適量體積的雜交緩沖雜交緩沖液液（10ml/100cm2濾膜）提前預(yù)熱到雜交溫度（37-42）。將點(diǎn)樣后的膜放入雜交緩沖液中在適當(dāng)?shù)娜萜髦袦睾驼袷?0分鐘進(jìn)行預(yù)雜交。注意：注意：膜應(yīng)該自由的移動(dòng)。

19、尤其是如果你在同一個(gè)預(yù)雜交溶液中放入幾張膜。2變性地高辛標(biāo)記的高辛標(biāo)記的DNA探針探針（在地高辛雜交液中濃度大約為25ng/mL）：將新標(biāo)記的探針放入沸水浴中煮5分鐘后快速快速放入冰水混合物中冷卻。注意：注意：因?yàn)镈IG-11-dUTP是堿標(biāo)記的，因此DNA探針不能用堿處理（NaOH）的方法變性。3將變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的地高辛雜交緩沖液（每100 cm2 的膜加入3.5 mL雜交緩沖液）中，充分混合但要避免產(chǎn)生泡沫（氣泡容易產(chǎn)生背景充分混合但要避免產(chǎn)生泡沫（氣泡容易產(chǎn)生背景）。4倒出預(yù)雜交液，向膜上加入探針雜交液的混合物。溫和振蕩孵育4小時(shí)或延長孵育至過夜。2、預(yù)雜交和雜交、預(yù)雜交

20、和雜交雜交液的儲(chǔ)存雜交液的儲(chǔ)存：含有地高辛標(biāo)記探針的地高辛雜交液可以儲(chǔ)存在-15到-25，可以反復(fù)使用幾次，在每次使用前需要每次使用前需要6868新鮮變性新鮮變性1010分鐘。分鐘。注意：不可以注意：不可以將雜交液煮沸。將雜交液煮沸。3、洗膜、洗膜步驟步驟操作操作1用足夠的2SSC, 0.1%SDS連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。1520。（低嚴(yán)謹(jǐn)度，高鹽低溫）（低嚴(yán)謹(jǐn)度，高鹽低溫）265，用足夠的0.5SSC, 0.1%SDS（提前預(yù)熱到洗滌溫度）連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。（高嚴(yán)謹(jǐn)度，低鹽高溫）（高嚴(yán)謹(jǐn)度，低鹽高溫）溶液溶液成分成分/制備制備儲(chǔ)存儲(chǔ)存/穩(wěn)定性穩(wěn)定性用途用途洗滌緩沖液0.1

21、M馬來酸，0.15M NaCl，pH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,穩(wěn)定膜的洗滌馬來酸緩沖液0.1M馬來酸，0.15M NaCl用NaOH(固體)調(diào)節(jié)pH值到7.5(20)15-25,穩(wěn)定封阻液的稀釋檢測(cè)緩沖液0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5(20)15-25,穩(wěn)定堿性磷酸酶的緩沖液需要附加的試劑需要附加的試劑4、免疫檢測(cè)、免疫檢測(cè)試劑盒工作溶液的制備試劑盒工作溶液的制備溶液溶液成分成分/制備方法制備方法儲(chǔ)存儲(chǔ)存/穩(wěn)定性穩(wěn)定性用途用途封阻溶液用馬來酸緩沖液按照1:10的比例將10封阻液（6號(hào)管）稀釋成1工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配封阻膜上非特異結(jié)合位點(diǎn)抗體溶液每次使用前將原始管中的anti-digoxigenin-AP（4號(hào)管）10000rpm離心5分鐘。然后從表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1:10000（150mU/mL）的比例稀釋anti-digoxigenin-AP2-8，12h現(xiàn)用現(xiàn)配與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合免疫檢測(cè)步驟：免疫檢測(cè)步驟：完成一張100cm2膜的免疫檢測(cè)方法注意：所有的孵育均是在注意：所有的孵育均是在15-2515-25下，振蕩完成的。如果膜