熒光紅外酶標(biāo)儀ppt課件

1、16.1 光學(xué)儀器簡介光學(xué)儀器簡介 16.2 酶標(biāo)儀的原理應(yīng)用及操作酶標(biāo)儀的原理應(yīng)用及操作16.3 熒光光譜儀原理應(yīng)用及操作熒光光譜儀原理應(yīng)用及操作16.4 紅外光譜儀原理應(yīng)用及操作紅外光譜儀原理應(yīng)用及操作16 酶標(biāo)儀、熒光光譜儀、紅外光譜儀的使用酶標(biāo)儀、熒光光譜儀、紅外光譜儀的使用16.1 光學(xué)儀器簡介光學(xué)儀器簡介一、光學(xué)知識回顧一、光學(xué)知識回顧1可見光的顏色和互補(bǔ)色：可見光的顏色和互補(bǔ)色： 在可見光范圍內(nèi)，不同波長的光的顏色是不同的。平常所見在可見光范圍內(nèi)，不同波長的光的顏色是不同的。平常所見的白光日光、白熾燈光等是一種復(fù)合光，它是由各種顏色的白光日光、白熾燈光等是一種復(fù)合光，它是由各種顏

2、色的光按一定比例混合而得的。利用棱鏡等分光器可將它分解成的光按一定比例混合而得的。利用棱鏡等分光器可將它分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等不同顏色的單色光。紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等不同顏色的單色光。 白光除了可由所有波長的可見光復(fù)合得到外，還可由適當(dāng)白光除了可由所有波長的可見光復(fù)合得到外，還可由適當(dāng)?shù)膬煞N顏色的光按一定比例復(fù)合得到。能復(fù)合成白光的兩的兩種顏色的光按一定比例復(fù)合得到。能復(fù)合成白光的兩種顏色的光叫互補(bǔ)色光。種顏色的光叫互補(bǔ)色光。 /nm顏色顏色互補(bǔ)光互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580

3、-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠完全吸收完全吸收完全透完全透過過吸收黃色光吸收黃色光光譜示意光譜示意表觀現(xiàn)象示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光復(fù)合光 2物質(zhì)的顏色與吸收光的關(guān)系：物質(zhì)的顏色與吸收光的關(guān)系： 當(dāng)白光照射到物質(zhì)上時，如果物質(zhì)對白光中某種顏色的光產(chǎn)當(dāng)白光照射到物質(zhì)上時，如果物質(zhì)對白光中某種顏色的光產(chǎn)生了選擇性的吸收，則物質(zhì)就會顯示出一定的顏色。物質(zhì)所生了選擇性的吸收，則物質(zhì)就會顯示出一定的顏色。物質(zhì)所顯示的顏色是吸收光的互補(bǔ)色。顯示的顏色是吸收光的互補(bǔ)色。物質(zhì)物質(zhì)顏色顏色吸收光吸收光物質(zhì)物質(zhì)顏色顏色吸收光吸收光顏色顏色波長范圍波長范圍nm）顏顏色色波長范圍波長范圍(nm)黃綠

4、黃綠紫紫400450紫紫綠綠560580黃黃藍(lán)藍(lán)450480藍(lán)藍(lán)黃黃580600橙橙綠藍(lán)綠藍(lán)480490綠藍(lán)綠藍(lán)橙橙600650紅紅藍(lán)綠藍(lán)綠490500藍(lán)綠藍(lán)綠紅紅650760紫紅紫紅綠綠500560 三原色三原色 RGB紅綠藍(lán)紅綠藍(lán) 印刷的三原色是印刷的三原色是RGB的互補(bǔ)色的互補(bǔ)色yellow黃，黃，cyan青，青，magenta品紅或者叫洋紅、紅紫品紅或者叫洋紅、紅紫 光分析法：基于電磁輻射能量與待測物質(zhì)相互作用后光分析法：基于電磁輻射能量與待測物質(zhì)相互作用后所產(chǎn)生的輻射信號與物質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)關(guān)系所建立起來的分所產(chǎn)生的輻射信號與物質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)關(guān)系所建立起來的分析方法；析方法； 電磁輻射范圍

5、：射線無線電波所有范圍；電磁輻射范圍：射線無線電波所有范圍； 相互作用方式：發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干相互作用方式：發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干預(yù)、衍射等；預(yù)、衍射等； 光分析法在研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析等方光分析法在研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位；面具有其他方法不可取代的地位；二、光分析法及其特點二、光分析法及其特點三個基本過程：三個基本過程：（1能源提供能量；能源提供能量；（2能量與被測物之間的相互作用；能量與被測物之間的相互作用；（3產(chǎn)生信號。產(chǎn)生信號。 基本特點：基本特點：（1所有光分析法均包含三個基本過程；所有光分析法均包含三個基本

6、過程；（2選擇性測量，不涉及混合物分離不同于色譜分選擇性測量，不涉及混合物分離不同于色譜分析）；析）；（3涉及大量光學(xué)元器件。涉及大量光學(xué)元器件。三、電磁輻射的基本性質(zhì)三、電磁輻射的基本性質(zhì)散射散射折射與反射折射與反射衍射衍射干預(yù)干預(yù)偏振偏振一一). 電磁輻射的波粒二象性電磁輻射的波粒二象性E = h = h c /c = =/吸收吸收 發(fā)射發(fā)射C=299,792,458米米/秒秒 躍遷類型躍遷類型分子振動分子振動分子轉(zhuǎn)動分子轉(zhuǎn)動電子、核自旋電子、核自旋三三)、本章儀器所用的光波、本章儀器所用的光波波譜區(qū)波譜區(qū)近紫外光近紫外光可見光可見光近紅外光近紅外光中紅外光中紅外光遠(yuǎn)紅外光遠(yuǎn)紅外光波長波長

7、200400nm400750nm0.752.5 m2.550 m501990 m躍遷躍遷類型類型原子外層電子原子外層電子分子成鍵電子分子成鍵電子分子振動分子振動分子轉(zhuǎn)動分子轉(zhuǎn)動酶標(biāo)儀、熒光分光光度計酶標(biāo)儀、熒光分光光度計紅外分光光度計紅外分光光度計 -射線射線5140 pm X-射線射線10-310nm 遠(yuǎn)紫外光遠(yuǎn)紫外光10200nm微波微波0.1100cm，射頻，射頻1100 m核磁共振）核磁共振）hiOAOA=hc/=hc/E=hc/(E1-E0)=hE=hc/(E1-E0)=hE= E1-E0 =hc/ hiE= E電子電子+ E振動振動+ E轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)動+ E平動平動=h(電子電子+振動振

8、動+轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)動+平動平動)=hc/(電子電子+振動振動+轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)動+平動平動)四、光分析法儀器的基本流程四、光分析法儀器的基本流程 光譜儀器通常包光譜儀器通常包括五個基本單元：括五個基本單元：光源；單色器；樣品光源；單色器；樣品；檢測器；顯示與數(shù)；檢測器；顯示與數(shù)據(jù)處理；據(jù)處理；五、光學(xué)分析儀器定量方法五、光學(xué)分析儀器定量方法式中：式中：A：吸光度；：吸光度；T:透射率；透射率；b：液層厚度：液層厚度(光程長度光程長度)，通常以，通常以cm為單位；為單位；c：溶液的摩爾濃度，單位：溶液的摩爾濃度，單位molL-1；：摩爾吸光系數(shù)，單位：摩爾吸光系數(shù)，單位Lmol-1cm-1；16.2 16.2 酶

9、標(biāo)儀的原理應(yīng)用及操作酶標(biāo)儀的原理應(yīng)用及操作變相的光電比色計或分光光度計變相的光電比色計或分光光度計 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀MicroplateReader是對酶聯(lián)免疫檢測是對酶聯(lián)免疫檢測EIA實驗結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)儀器。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過實驗結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)儀器。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過偶聯(lián)在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進(jìn)行的，反應(yīng)結(jié)果偶聯(lián)在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進(jìn)行的，反應(yīng)結(jié)果以顏色顯示，通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判以顏色顯示，通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判斷標(biāo)本中待測抗體或抗原的濃度。斷標(biāo)本中待測抗體或抗原的濃度。 酶標(biāo)法又稱固相酶免疫測定酶標(biāo)法又稱固相酶免疫測定 ，含，

10、含3個必要的試劑：固相個必要的試劑：固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶反應(yīng)的底物。雙的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶反應(yīng)的底物。雙抗體夾心法抗體夾心法(抗原）、間接法抗體）、競爭法抗原或抗抗原）、間接法抗體）、競爭法抗原或抗體）。體）。 1、酶標(biāo)儀簡介、酶標(biāo)儀簡介2 2、酶標(biāo)儀能干什么？、酶標(biāo)儀能干什么？酶標(biāo)儀廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、酶標(biāo)儀廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)中食品和環(huán)境科學(xué)中 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 RCHIgG和和IgM檢查通常也稱為優(yōu)生優(yōu)育十項檢查檢查通常也稱為優(yōu)生優(yōu)育十項檢查 ；T3、T4、TSH、TOR

11、CH系列、不孕系列、各種癌癥標(biāo)志物、系列、不孕系列、各種癌癥標(biāo)志物、傷寒、副傷寒傷寒、副傷寒 ；另外通過母嬰傳播的性傳播疾病如淋病、；另外通過母嬰傳播的性傳播疾病如淋病、梅毒、梅毒、HIV和肝炎如和肝炎如HBV、HCV），以及胎兒的抗體，），以及胎兒的抗體，新生兒新生兒TSH的測定，疫苗反應(yīng)等。的測定，疫苗反應(yīng)等。免疫診斷方法：放免免疫診斷方法：放免RIA）、酶免）、酶免EIA和和 發(fā)光發(fā)光 國內(nèi)國內(nèi) 衰退期衰退期 成長期成長期 進(jìn)入期進(jìn)入期 國外國外 淘汰淘汰 飽和期飽和期 成熟期成熟期光源系統(tǒng)光源系統(tǒng)濾光系統(tǒng)濾光系統(tǒng)樣品室樣品室檢測器檢測器微處理器控制系統(tǒng)微處理器控制系統(tǒng)3、酶標(biāo)儀的結(jié)構(gòu)、

12、酶標(biāo)儀的結(jié)構(gòu)常用的三種檢測方法常用的三種檢測方法（一抗體夾心法（一抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。具體操作步驟如下：雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。具體操作步驟如下： （1特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)固相抗體固相抗體洗滌雜質(zhì)。洗滌雜質(zhì)。（2受檢標(biāo)本與固相抗體接觸反應(yīng)受檢標(biāo)本與固相抗體接觸反應(yīng)標(biāo)本中的抗原與固相抗體標(biāo)本中的抗原與固相抗體固相抗原抗體復(fù)合物固相抗原抗體復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。固相載

13、體上帶有的酶量就徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。固相載體上帶有的酶量就代表標(biāo)本中受檢抗原的量。代表標(biāo)本中受檢抗原的量。（4加底物顯色。夾心式復(fù)合物中的酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物。加底物顯色。夾心式復(fù)合物中的酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。二價及以上大分子抗原的檢出和定量分析，二價及以上大分子抗原的檢出和定量分析，不能用于半抗原等小分子的測定不能用于半抗原等小分子的測定 （二間接法（二間接法 其原理為利用酶標(biāo)記的抗體來檢測已與固其原理為利用酶標(biāo)記的抗體來檢測已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體。操作步驟如下：相抗原結(jié)合的受檢抗體。操作步驟如

14、下： （1特異體抗原固相載體聯(lián)結(jié)特異體抗原固相載體聯(lián)結(jié) 固相抗原洗滌除去雜質(zhì)。固相抗原洗滌除去雜質(zhì)。（2稀釋的受檢血清中的特異性抗體固相抗原結(jié)合，形成稀釋的受檢血清中的特異性抗體固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌后固相載體上只留下特異性抗體。固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌后固相載體上只留下特異性抗體。（3酶標(biāo)抗免疫球蛋白酶標(biāo)抗體），與固相復(fù)合物中的抗酶標(biāo)抗免疫球蛋白酶標(biāo)抗體），與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，該抗體間接地標(biāo)記上酶。清洗后，固相載體上的酶體結(jié)合，該抗體間接地標(biāo)記上酶。清洗后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。量就代表特異性抗體的量。（4加底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體量。加

15、底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體量。（三競爭法（三競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因而，原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因而，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成正比。結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成正比。 （1特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。然后洗特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。然后洗滌。滌。（2待測管中加入受檢標(biāo)本與一定量的酶標(biāo)抗原的混合溶待測管中加入受檢標(biāo)本與一定量的酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。若受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)

16、抗原液，使之與固相抗體反應(yīng)。若受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。若受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)能順利地與固相抗體結(jié)合。若受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合。這樣，受檢標(biāo)本中抗原量抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合。這樣，受檢標(biāo)本中抗原量越高，則由于這些抗原與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)越高，則由于這些抗原與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合量抗原與固相抗體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合量越少。越少?！皡⒖脊軈⒖脊苤兄患用笜?biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)

17、合可達(dá)最充分的量。然后洗滌。抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。然后洗滌。（3加底物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原量最多，加底物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原量最多，故顏色最深。參考管中顏色深度與待測管顏色深度之差，代表故顏色最深。參考管中顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本中抗原的量。待測管越淡，表示標(biāo)本中抗原量越多。受檢標(biāo)本中抗原的量。待測管越淡，表示標(biāo)本中抗原量越多。一、盛裝比色液的容器不是使用比色皿，而是塑料微孔板。一、盛裝比色液的容器不是使用比色皿，而是塑料微孔板。塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，它對抗原或抗體塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作，它對抗原或抗體有較強(qiáng)的吸附；有較強(qiáng)

18、的吸附；二、酶標(biāo)儀的光束是垂直通過待測液的；二、酶標(biāo)儀的光束是垂直通過待測液的；三、酶標(biāo)儀通常不使用三、酶標(biāo)儀通常不使用A而是使用光密度而是使用光密度OD來表示吸光度。來表示吸光度。 酶標(biāo)儀和普通光電比色計的不同酶標(biāo)儀和普通光電比色計的不同1、儀器應(yīng)放置在無磁場和干擾電壓的位置、低于、儀器應(yīng)放置在無磁場和干擾電壓的位置、低于40分貝分貝的環(huán)境下。的環(huán)境下。2、為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽光直射。、為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽光直射。3、操作時環(huán)境溫度應(yīng)在、操作時環(huán)境溫度應(yīng)在1540之間，環(huán)境濕度在之間，環(huán)境濕度在15%85%之間。之間。4、操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。、操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。5、操作

19、環(huán)境空氣清潔，避免水汽，煙塵。、操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽，煙塵。6、保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作、保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間?？臻g。 4 4、酶標(biāo)儀工作環(huán)境、酶標(biāo)儀工作環(huán)境5、酶標(biāo)儀操作注意事項、酶標(biāo)儀操作注意事項 1、使用加液器加液，加液頭不能混用。、使用加液器加液，加液頭不能混用。2、洗板要干凈。最好使用洗板機(jī)洗板，避免交叉污染。、洗板要干凈。最好使用洗板機(jī)洗板，避免交叉污染。3、嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，反應(yīng)時間準(zhǔn)確。、嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，反應(yīng)時間準(zhǔn)確。4、測量時勿碰酶標(biāo)板，以防擠傷。、測量時勿碰酶標(biāo)板，以防擠傷。5、勿將樣品或試劑灑

20、到儀器表面或內(nèi)部，操作完畢后要洗手。、勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部，操作完畢后要洗手。6、具有污染性、毒性和生物學(xué)危害的樣品或試劑，嚴(yán)格按照、具有污染性、毒性和生物學(xué)危害的樣品或試劑，嚴(yán)格按照操作說明，以防對操作人員造成損害。用后并及時清洗和操作說明，以防對操作人員造成損害。用后并及時清洗和消毒。消毒。7、不得在測量過程中關(guān)閉電源。、不得在測量過程中關(guān)閉電源。8、使用后蓋好防塵罩。、使用后蓋好防塵罩。9、切勿擅自拆卸酶標(biāo)儀。、切勿擅自拆卸酶標(biāo)儀。16.3 熒光光譜儀原理應(yīng)用及操作熒光光譜儀原理應(yīng)用及操作v西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.MonardesN.Monar

21、des，15751575年他提到在年他提到在含有一種稱為含有一種稱為“Lignum NephriticumLignum Nephriticum的木頭切片的水溶液的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍(lán)色中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍(lán)色( (第一次記錄熒光現(xiàn)象第一次記錄熒光現(xiàn)象) )。v直到直到18521852年，年，StokesStokes在考察奎寧和葉綠素在吸收光能后重新在考察奎寧和葉綠素在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“

22、螢石螢石推演而提出推演而提出“熒光熒光這一術(shù)語。這一術(shù)語。v18671867年，年，GoppelsroderGoppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁應(yīng)用鋁桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。v1919世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到19281928年，才年，才由由JetteJette和和WestWest提出了第一臺熒光計。提出了第一臺熒光計。一、歷史一、歷史原子熒光光譜法是原子熒光光譜法是19641964年以后發(fā)展起來的分析方法。年以后發(fā)展起來的分析方法。原子熒光光

23、譜法是以原子在輻射能激發(fā)下發(fā)射的熒光強(qiáng)度原子熒光光譜法是以原子在輻射能激發(fā)下發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析的發(fā)射光譜分析法。所用儀器與原子吸收光進(jìn)行定量分析的發(fā)射光譜分析法。所用儀器與原子吸收光譜法相近。譜法相近。中國自主知識產(chǎn)權(quán)的光譜分析儀器，世界第一臺原子中國自主知識產(chǎn)權(quán)的光譜分析儀器，世界第一臺原子熒光光譜儀誕生在中國北京海光儀器公司）熒光光譜儀誕生在中國北京海光儀器公司）熒光光譜法分為原子熒光和分子熒光兩種熒光光譜法分為原子熒光和分子熒光兩種熒光分光光度計的發(fā)展經(jīng)歷了手控式熒光分光光度計，自熒光分光光度計的發(fā)展經(jīng)歷了手控式熒光分光光度計，自動記錄式熒光分光光度計，計算機(jī)控制式熒光分光光度計

24、三個動記錄式熒光分光光度計，計算機(jī)控制式熒光分光光度計三個階段；熒光分光光度計還可分為單光束式熒光分光光度計和雙階段；熒光分光光度計還可分為單光束式熒光分光光度計和雙光束式熒光分光光度計兩大系列。其他的還有低溫激光光束式熒光分光光度計兩大系列。其他的還有低溫激光Sh p olskill熒光分光光度計，配有壽命和相分辯測定的熒光分光光熒光分光光度計，配有壽命和相分辯測定的熒光分光光度計等度計等 分子的活化與去活化分子的活化與去活化紫紫外外可可見見吸吸收收光光譜譜外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移紫紫外外可可見見共共振振熒熒光光光光譜譜內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光熒光系間系間竄躍竄躍磷磷光光反系間反系間竄躍竄躍遲遲滯滯熒熒光光振動

25、弛豫振動弛豫振動弛豫振動弛豫: Vr 10-12sec外外 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移:無輻射躍遷無輻射躍遷回到基態(tài)回到基態(tài)內(nèi)內(nèi) 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移:S2S1能級能級之間有重疊之間有重疊系間竄躍系間竄躍: S2T1能級能級之間有重疊之間有重疊反系間竄躍反系間竄躍:由外部獲由外部獲取能量后取能量后 T1 S2. 輻射躍遷的類型輻射躍遷的類型共振熒光：共振熒光：10-12 sec熒熒 光：光：10-8 sec磷磷 光：光：110-4 sec遲滯熒光遲滯熒光:10210-4 secAAFF二二. . 熒光的發(fā)光類型熒光的發(fā)光類型起源于基態(tài)的起源于基態(tài)的共振熒光共振熒光熱助熱助共振熒光共振熒光1. 共振熒光共振熒光發(fā)射與吸收

26、線波發(fā)射與吸收線波長相同的熒光長相同的熒光AAFF起源于基態(tài)的起源于基態(tài)的直躍線熒光直躍線熒光起源于亞穩(wěn)態(tài)的起源于亞穩(wěn)態(tài)的直躍線熒光直躍線熒光AAFF正常的正常的階躍線熒光階躍線熒光熱助熱助階躍線熒光階躍線熒光AAFF起源于亞穩(wěn)態(tài)起源于亞穩(wěn)態(tài)階躍激發(fā)熒光階躍激發(fā)熒光起源基態(tài)起源基態(tài)階躍激發(fā)熒光階躍激發(fā)熒光2. 非共振熒光非共振熒光熒光的波長與激發(fā)光不同時熒光的波長與激發(fā)光不同時Stores熒光熒光:直躍線熒光、階躍線熒光直躍線熒光、階躍線熒光 Anti-stores熒光：熒光： 階躍激發(fā)熒光階躍激發(fā)熒光三、三、 主要組成及部件的功能主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖熒光

27、分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源光源氙氙燈燈激發(fā)單色器激發(fā)單色器樣品池樣品池光電倍增管光電倍增管數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理儀器控制儀器控制光源光源樣品池樣品池激發(fā)激發(fā)單色器單色器檢測器檢測器數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理儀器控制儀器控制發(fā)射發(fā)射單色器單色器發(fā)射單色器發(fā)射單色器消除散射消除散射光和入射光和入射光的干擾光的干擾熒光分光光度計的類型熒光分光光度計的類型歷程：手控式熒光分光光度計、自動記錄式熒光分光光度歷程：手控式熒光分光光度計、自動記錄式熒光分光光度計和計算機(jī)控制式熒光分光光度計。計和計算機(jī)控制式熒光分光光度計。類型：單光束、雙光束熒光分光光度計、低溫激光類型：單光束、雙光束熒光分光光度計、低溫激光S

28、hpolskill熒光分光光度計熒光分光光度計 、配有壽命和相分辯測定的熒、配有壽命和相分辯測定的熒光分光光度計等。光分光光度計等。主要產(chǎn)品：主要產(chǎn)品： 天津港東生產(chǎn)的天津港東生產(chǎn)的F-380型、型、F-320型、型、F-280型；型； 天津拓普生產(chǎn)的天津拓普生產(chǎn)的WFY-28型熒光分光光度計；型熒光分光光度計； 上海精密生產(chǎn)的上海精密生產(chǎn)的970CRT型熒光分光光度計；型熒光分光光度計； 上海棱光生產(chǎn)的上海棱光生產(chǎn)的F96型熒光分光光度計型熒光分光光度計 等等日本島津日本島津 RF-531PC 11萬萬日立日立F-4500 21.2萬萬原子熒光原子熒光 PF6-3 9.9萬萬 儀器光路圖儀器

29、光路圖該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析；該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析；在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機(jī)化合物很少，主要依賴于在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機(jī)化合物很少，主要依賴于有機(jī)試劑形成的螯合物。有機(jī)試劑形成的螯合物。四四. 熒光分析的應(yīng)用熒光分析的應(yīng)用1. 無機(jī)化合物無機(jī)化合物v 直接熒光測定法直接熒光測定法其中，較常測定的元素有：其中，較常測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達(dá)到與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達(dá)到10-10;某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會與某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物

30、，但是它會與發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度此該元素的含量。熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度此該元素的含量。較常測定的元素有：較常測定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、Wv 熒光熄滅測定法熒光熄滅測定法 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)

31、化合物熒光測芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測定的主要類型。定的主要類型。. . 有機(jī)化合物有機(jī)化合物待測物待測物試劑試劑 exmaxemmax測定范圍測定范圍 ppm丙三醇丙三醇苯胺苯胺紫外紫外藍(lán)色藍(lán)色0.12糠醛糠醛蒽酮蒽酮4655051.515氨基酸氨基酸氧化酶氧化酶3154250.0150維生素維生素A無水乙醇無水乙醇345490020蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)曙紅丫曙紅丫紫外紫外5400.066腎上腺素腎上腺素乙二胺乙二胺4205250.0010.02 青霉素青霉素-甲氧基甲氧基-氯氯-(-氨氨乙基乙基)-氨基氮雜蒽氨基氮雜蒽4205000.06250.625玻璃酸梅玻璃酸梅3-

32、乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚3954700.0010.033胍基丁胺胍基丁胺鄰苯二醛鄰苯二醛3654700.055四氧嘧啶四氧嘧啶苯二胺苯二胺36548510-4NoImage3.生物化學(xué)及生理醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用生物化學(xué)及生理醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 因熒光法有很高的靈敏度和較好的特效性，在生物化學(xué)及因熒光法有很高的靈敏度和較好的特效性，在生物化學(xué)及生理醫(yī)學(xué)方面有重要應(yīng)用。生理醫(yī)學(xué)方面有重要應(yīng)用。例：用熒光法研究氨基酸和蛋白質(zhì)。雖然游離氨基酸中能例：用熒光法研究氨基酸和蛋白質(zhì)。雖然游離氨基酸中能產(chǎn)生熒光的只有幾個帶苯環(huán)的氨基酸如色氨酸、酪氨產(chǎn)生熒光的只有幾個帶苯環(huán)的氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯基丙氨酸，然而，某些

33、蛋白質(zhì)含有熒光輔酶酸和苯基丙氨酸，然而，某些蛋白質(zhì)含有熒光輔酶(Fluorescent coenzyme)，熒光輔酶生色劑可用于許多，熒光輔酶生色劑可用于許多蛋白質(zhì)的熒分析中。蛋白質(zhì)的熒分析中。 例：鎮(zhèn)靜劑利血平具有熒光，它還可氧化成具有更強(qiáng)烈熒例：鎮(zhèn)靜劑利血平具有熒光，它還可氧化成具有更強(qiáng)烈熒光的產(chǎn)物再進(jìn)行分析。光的產(chǎn)物再進(jìn)行分析。 紫外紫外- -可見分光光度計可見分光光度計: :光源光源樣品池樣品池單色器單色器檢測器檢測器數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理儀器控制儀器控制熒光分光光度計熒光分光光度計: :光源光源樣品池樣品池激發(fā)激發(fā)單色器單色器檢測器檢測器數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理儀器控制儀器控制發(fā)射發(fā)射單色器單色器

34、紫外紫外-可見分光光度計可見分光光度計測量池測量池(吸收池吸收池)I0ItI0ItIF,p16.3 紅外光譜儀原理應(yīng)用及操作簡介紅外光譜儀原理應(yīng)用及操作簡介 1892年發(fā)現(xiàn)，凡是含有甲基的物質(zhì)都會強(qiáng)烈地吸收波長年發(fā)現(xiàn)，凡是含有甲基的物質(zhì)都會強(qiáng)烈地吸收波長3.4m的紅外光，從而推斷凡是在該波長處產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收的的紅外光，從而推斷凡是在該波長處產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收的物質(zhì)都含有甲基。物質(zhì)都含有甲基。 這種利用樣品對不同波長紅外光的吸收程度研究物質(zhì)的分這種利用樣品對不同波長紅外光的吸收程度研究物質(zhì)的分子組成和結(jié)構(gòu)的方法，稱為紅外分子吸收光譜法。到子組成和結(jié)構(gòu)的方法，稱為紅外分子吸收光譜法。到1905年前年前后，

35、人們已系統(tǒng)研究了數(shù)百種化合物的紅外吸收光譜，并總結(jié)后，人們已系統(tǒng)研究了數(shù)百種化合物的紅外吸收光譜，并總結(jié)了一些物質(zhì)分子基團(tuán)與其紅外吸收帶之間的關(guān)系。了一些物質(zhì)分子基團(tuán)與其紅外吸收帶之間的關(guān)系。 1930年有人用群論和量子力學(xué)方法計算了許多簡單分子的年有人用群論和量子力學(xué)方法計算了許多簡單分子的基頻和鍵力常數(shù)，發(fā)展了紅外光譜的理論研究。基頻和鍵力常數(shù)，發(fā)展了紅外光譜的理論研究。 2、紅外光譜的定義：、紅外光譜的定義：紅外光譜屬分子吸收光譜。樣品受到頻率連續(xù)變化紅外光譜屬分子吸收光譜。樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時，分子吸收其中一些頻率的輻射，分子的紅外光照射時，分子吸收其中一些頻率的輻射，分

36、子振動或轉(zhuǎn)動引起偶極矩的凈變化，使振振動或轉(zhuǎn)動引起偶極矩的凈變化，使振-轉(zhuǎn)能級從基態(tài)躍轉(zhuǎn)能級從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，相應(yīng)于這些區(qū)域的透射光強(qiáng)減弱，記錄百遷到激發(fā)態(tài)，相應(yīng)于這些區(qū)域的透射光強(qiáng)減弱，記錄百分透過率分透過率T%對波數(shù)或波長的曲線，即紅外光譜。對波數(shù)或波長的曲線，即紅外光譜。主要用于化合物鑒定及分子結(jié)構(gòu)表征，是有機(jī)化合主要用于化合物鑒定及分子結(jié)構(gòu)表征，是有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)解析的重要工具，根據(jù)有機(jī)化合物紅外特征吸物的結(jié)構(gòu)解析的重要工具，根據(jù)有機(jī)化合物紅外特征吸收頻率，確定化合物結(jié)構(gòu)中基團(tuán)；亦可用于定量分析：收頻率，確定化合物結(jié)構(gòu)中基團(tuán)；亦可用于定量分析：依據(jù)特征峰的強(qiáng)度變化進(jìn)行定量分析。依據(jù)特征峰的強(qiáng)度變化進(jìn)行定量分析。分子中基團(tuán)的振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜。分子中基團(tuán)的振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜。紅外光譜也稱分子的振、轉(zhuǎn)動光譜。紅外光譜也稱分子的振、轉(zhuǎn)動光譜。波譜區(qū)波譜區(qū)近紅外光近紅外光中紅外光中紅外光遠(yuǎn)紅外光遠(yuǎn)紅外光波長波長/ m0.752.52.550501000波數(shù)波數(shù)/ cm-1 133334000400020020010躍遷類型躍遷類型分子振動分子振動分子轉(zhuǎn)動分子轉(zhuǎn)動近紅外光譜區(qū)：近紅外光譜區(qū)：1980S低能電子能級躍遷低能電子能級躍遷含氫原子團(tuán)：含氫原子團(tuán)：-OH、 -NH、-CH伸縮振動的伸縮振動的倍頻吸收峰倍頻吸收峰稀土及過渡金屬離子配稀土及過渡金