分子伴侶的研究進(jìn)展作業(yè)

1、生物化學(xué)課程期末論文分子伴侶的研究進(jìn)展孫杰 11041101212011/12/9分子伴侶的研究進(jìn)展摘 要：分子伴侶能結(jié)合和穩(wěn)定另一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象,促進(jìn)新生多肽鏈的正確折疊, 因而在輔助蛋白質(zhì)復(fù)性以及免疫保護(hù)等方面有很重要的作用。HSP70分子伴侶能夠幫助細(xì)胞內(nèi)新生蛋白的折疊和跨膜運(yùn)輸、蛋白質(zhì)多聚體結(jié)構(gòu)的裝配和解裝配,并能在脅迫下維持蛋白質(zhì)的特殊構(gòu)象, 防止未折疊的蛋白質(zhì)變性和使聚集的蛋白質(zhì)溶解復(fù)性。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)折疊；分子伴侶；熱休克蛋白 1.蛋白質(zhì)折疊 一個(gè)有活性的蛋白質(zhì)分子不但有特定的氨基酸序列，還處于特定的由氨基酸序列決定的三維空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)分子生物學(xué)的中心法則，生命的遺傳信息在

2、核內(nèi)從DNA轉(zhuǎn)錄到RNA在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸序列，實(shí)際上這只是合成出了新生肽鏈但還不是蛋白質(zhì)，這種新生肽鏈必須經(jīng)歷一系列極其復(fù)雜的折疊過程，這里的“折疊”不僅指肽鏈在空間的盤旋卷曲，而是包括廣義的新生肽鏈的整個(gè)成熟過程，包括化學(xué)修飾、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、亞基組裝、水解激活等等。2.蛋白質(zhì)折疊研究的新概念20世紀(jì)60年代nfinsen根據(jù)還原變性的牛胰核糖核酸酶在去除變性劑和還原劑后,不需要任何其他物質(zhì)的幫助能夠自發(fā)地形成正確的4對(duì)二硫鍵，重新折疊成天然的三維結(jié)構(gòu)并恢復(fù)幾乎全部生物活性的實(shí)驗(yàn)，提出“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息”或者說“一級(jí)結(jié)

3、構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)”的著名論斷。相對(duì)于體外蛋白質(zhì)折疊研究，細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈的成熟實(shí)際上是在較高的溫度、較高的蛋白濃度而又十分擁擠的環(huán)境中，以極快的速度和極高的保真度在進(jìn)行著。一句話，以極高的效率在進(jìn)行著。新的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)新生肽折疊和成熟為功能蛋白，一般說來是需要幫助的，而不都是能自發(fā)進(jìn)行而完成的。幫助新生肽折疊的生物大分子主要是蛋白質(zhì)，它分為兩大類:一類是分子伴侶；一類是催化與折疊直接有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)的酶，現(xiàn)在又稱“折疊酶”，目前已確定為幫助蛋白質(zhì)折疊的酶只有2個(gè)，一個(gè)是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomease,PDI）;另一個(gè)是肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidy

4、 prolyl cis-trans isomerase,PPI)。它們都催化共價(jià)的異構(gòu)反應(yīng)1。3. 分子伴侶與蛋白質(zhì)折疊1978年，英國的Laskey發(fā)現(xiàn)DNA和組蛋白在體外生理離子強(qiáng)度條件下重組時(shí)，必須有細(xì)胞核內(nèi)一種酸性蛋白-核質(zhì)素(nucleoplasmin)存在時(shí)才能成功組裝成核小體，否則就會(huì)發(fā)生沉淀。Laskey把它叫做“分子伴侶（molecular chaprone）”。蛋白質(zhì)必須經(jīng)折疊形成精確的三維結(jié)構(gòu)才具有生物活性。然而在熱應(yīng)激或其它應(yīng)激條件下, 蛋白質(zhì)折疊常常會(huì)受到損傷,表現(xiàn)為折疊中間體的疏水區(qū)暴露,發(fā)生異常反應(yīng)(如集聚等) ,形成蛋白質(zhì)聚合物。分子伴侶在蛋白質(zhì)正確折疊中起著關(guān)

5、鍵性作用。 首先, 它可調(diào)節(jié)性地阻礙多肽鏈集聚; 其次,分子伴侶還具有折疊互補(bǔ)功能,即可使已形成的蛋白質(zhì)集聚體折疊和恢復(fù)其水溶性; 此外, 分子伴侶可以促進(jìn)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)降解。 4.分子伴侶的分類24. 1 伴侶素家族( Charperonin, Cpn)Cpn 家族具有獨(dú)特的雙層7- 9 元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡聚蛋白( Hemminngwen; cheng 1998) , 它們以依賴ATP 方式促進(jìn)體內(nèi)正常和應(yīng)急條件下蛋白質(zhì)折疊。Cpns 又可分為兩組: GroEl( Hsp60)家族和Tric家族。GroEl 的Cpn 由雙層7 個(gè)亞基形成圓環(huán)組成, 每個(gè)亞基分子量約為 60ku。它們?cè)隗w內(nèi)與一

6、種輔助因子,如E.coli中的GroEs,協(xié)同作用幫助蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)一般是應(yīng)急反應(yīng)誘導(dǎo)的,人們對(duì)GroE 和GroEs 的結(jié)構(gòu)、 功能及作用機(jī)理作了詳細(xì)研究。Tric型的Cpn 是由雙層8 或9元組成,亞基分子量約為55k。 該種Cpn 沒有類似的輔助因子。4. 2 熱休克蛋白70家族由于該家族是進(jìn)化上最保守的蛋白質(zhì)之一,在應(yīng)用上具有廣闊的前景, 因此是研究最多的家族。HSP70廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠素等細(xì)胞的各個(gè)部分, 它作為分子伴侶參與所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的從頭合成和定位、蛋白質(zhì)的成熟和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解及調(diào)節(jié)過程, 因而能夠嚴(yán)重地影響生長(zhǎng)在正常條件和脅迫條件下生

7、存的細(xì)胞功能和代謝過程。4. 3 熱休克蛋白90家族熱休克蛋白90 家族(Hsp 90 family) ,分子量在90ku左右。 Hsp90可以與腦漿中的類固醇激素受體結(jié)合, 封閉受體的DNA 結(jié)合域,阻礙其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的激活作用, 使之保持在天然的非活性狀態(tài)。但Hsp90的結(jié)合也使受體保持著對(duì)激素配體的高親和力。Hsp還與Ras信號(hào)途徑中許多信號(hào)分子的折疊與組裝密切相關(guān), 主要是Hsp90 的結(jié)合與解離導(dǎo)致了這些分子在活性與非活性之間的轉(zhuǎn)化。4. 4 其它種類的分子伴侶包括核質(zhì)素、T 受體結(jié)合蛋白(TRAP)、大腸桿菌的SecB和觸發(fā)因子(trigger factor)及PapD、噬菌體

8、編碼的支架蛋白(scaf folding proteins)等。它們相應(yīng)的功能如表一所示。表1 分子伴侶及其功能（引自BBRC,1997,238,687-692）名稱生物功能核質(zhì)素?zé)嵝菘说鞍?0大腸桿菌CroERubisco亞基結(jié)合蛋白真核細(xì)胞胞質(zhì)TCPI熱休克蛋白70大腸桿菌DnaK線粒體Hsp70,酵母SSCI熱休克蛋白90細(xì)胞質(zhì)Hsp90酵母HSP82DnaJCrpESecB信號(hào)識(shí)別粒子前導(dǎo)肽PapDLim卵中核小體組裝和拆卸新生肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊新生肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊激素受體蛋白折疊和Hsp70及CrpE協(xié)同作用和Hsp70及DnaJ協(xié)同作用細(xì)菌多肽轉(zhuǎn)運(yùn)新生肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水解酶折疊細(xì)菌鞭毛組裝細(xì)

9、菌脂肪酶折疊5.HSP70 分子伴侶系統(tǒng)研究進(jìn)展HSP70 家族是進(jìn)化史上最保守的蛋白質(zhì)之一。它的家族成員包括四個(gè): grp78、mtp70、hsc70及hsp70。前三種是在正常條件下產(chǎn)生的, 而hsp70是由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生。HSP70同疏水的肽類有高親和力, 并且隨著ATP的水解而增高3。HSP70與多肽之間的可逆作用在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、錯(cuò)誤折疊多肽的降解及其調(diào)控過程中有重要作用。HSP70之所以能起如此重要的作用是由它的結(jié)構(gòu)決定的。5. 1 HSP70 的結(jié)構(gòu)HSP70結(jié)構(gòu)由兩部分組成,一部分主要由一個(gè)N端高度保守的44ku的三磷酸腺苷酶(ATPase) 功能域(ATP binding

10、domain) ; 另一部分由一個(gè)分子質(zhì)量為25ku的C端區(qū)域組成。N端ATPase 功能域的結(jié)構(gòu)類似于凝聚素和己糖激酶,主要由兩個(gè)大的球形亞功能域I和II 組成,其間被一個(gè)深的中央裂縫分開,并通過2個(gè)交叉的螺旋相連接;亞功能域和連接的螺旋和裂縫的底部形成一個(gè)核苷酸及所需的Mg2+和 K+的結(jié)合袋,核苷酸經(jīng)過與兩個(gè)磷酸結(jié)合環(huán)和一個(gè)疏水腺苷的相互作用而定位在活性部位4,并與HSC70側(cè)鏈結(jié)合的Mg2+相聯(lián)系。C端區(qū)域又分一個(gè)保守的15ku的多肽的結(jié)構(gòu)功能域和一個(gè)不保守的靠近C 端的10ku可變區(qū)功能域, Zhu5等在 1996 年研究表明 Dnak( HSC70)底物結(jié)合功能域和端分可變區(qū)域重組

11、片段的結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成,第一部(N 端) 折疊或一個(gè)緊密的-三明治(- sandwich)結(jié)構(gòu)。第二部分( C 端)由5個(gè)螺旋組成,形成一個(gè)松弛的螺旋結(jié)構(gòu)（如圖1）。松弛構(gòu)象的多肽結(jié)合在由-三明治結(jié)構(gòu)形成的底物結(jié)合通道中, 而螺旋部分位于多肽結(jié)合單位之上, 象一個(gè)蓋子覆蓋在結(jié)合通道上面,而不與底物直接接觸,所以能阻止結(jié)合底物的逃脫。圖 1DnaK C 端區(qū)域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1Topology structure of DnaK C terminal domain5. 2 HSP70 的作用機(jī)理HSP70的ATPase活性很弱,活體內(nèi)它通常可能處于ATP 結(jié)合狀態(tài)(螺旋蓋子處于開的狀

12、態(tài)),在次狀態(tài)下,它們不能穩(wěn)定地結(jié)合多肽,可是,如何從事蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)呢?Hartl6研究表明 HSP70 ATP 的水解反應(yīng)周期包括 5個(gè)步驟(圖2) : A、分子伴侶DnaJ首先暫時(shí)與未折疊多肽迅速結(jié)合。B、DnaK-ATP 與DnaJ的J功能域通過未確定的 DnaK的結(jié)合位點(diǎn)相互作用,然后把蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)移到打開的DnaK-ATP底物結(jié)合袋中。即DnaK-ATP從DnaJ-底物復(fù)合物中接受多肽。C、DnaJ 與DnaK相互作用促進(jìn)ATP水解,并使未折疊多肽DnaK復(fù)合物穩(wěn)定地處于ADP結(jié)合狀態(tài);然后DnaJ從DnaK-ADP-底物-DnaJ三元復(fù)合物解離下來。D、核苷酸交換因子GrpE與D

13、naK-ADP-底物復(fù)合物結(jié)合, 引起ADP的釋放。E、ATP 快速與DnaK 結(jié)合,螺旋蓋子打開,引起底物和GrpE的釋放, DnaK 恢復(fù)到起始狀態(tài)。解離的底物將進(jìn)一步折疊,或重新與DnaJ和DnaK結(jié)合或轉(zhuǎn)移到其他的分子伴侶系統(tǒng)(如GroE) , 完成最后的折疊。圖 2Hsp70 分子伴侶系統(tǒng)作用模式示意圖Fig . 2Structure and function of the Hsp70 system5. 3 HSP70 的功能HSP70 廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠素等細(xì)胞的各個(gè)部分7, 它作為分子伴侶參與所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的從頭合成和定位、蛋白質(zhì)的成熟和錯(cuò)誤折疊蛋白

14、質(zhì)的降解及調(diào)節(jié)過程8, 因而能夠嚴(yán)重地影響生長(zhǎng)在正常條件和脅迫條件下生存的細(xì)胞功能和代謝過程。5. 3. 1 脅迫下HSP70 的功能HSP70 在脅迫下的保護(hù)功能知道很少。體外實(shí)驗(yàn)表明DnaK 能溶解某些熱變性蛋白的聚集物,但是活體內(nèi)分子伴侶在脅迫下的保護(hù)機(jī)理則主要是通過與脅迫誘導(dǎo)的未折疊底物多肽的結(jié)合而阻止其聚集變性。如轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞放在42,其中表達(dá)的螢火蟲螢光素酶活性喪失,若在此熱脅迫期間細(xì)胞內(nèi)有DnaK、DnaJ和GrpE功能多肽存在時(shí), 其酶活性在30時(shí)又可以得以恢復(fù),反之則不能恢復(fù)9,說明分子伴侶在脅迫下能夠具有保護(hù)酶結(jié)構(gòu)的作用。5. 3. 2 在蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸中的作用在

15、細(xì)胞中蛋白質(zhì)在核糖體上合成。數(shù)以萬計(jì)的蛋白質(zhì)合成以后分送到細(xì)胞各部分(細(xì)胞液、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等等)，有的則分泌至胞外。 由于細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分,因此合成的蛋白質(zhì)必須定向地、 準(zhǔn)確無誤地進(jìn)行運(yùn)送,才能保證細(xì)胞活動(dòng)的正常進(jìn)行10。HSP70不僅能幫助線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新輸入蛋白質(zhì)的折疊, 而且參與蛋白質(zhì)的移位過程, 實(shí)驗(yàn)證明HSP70 用一種類似于棘輪的分子機(jī)制促進(jìn)蛋白質(zhì)移位。116.分子伴侶應(yīng)用前景6. 1 輔助蛋白質(zhì)復(fù)性重組DNA 技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白提供了嶄新的途徑。但人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)卻遇到了意想不到的困難: 很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表

16、達(dá)產(chǎn)物如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白介素-6、人-干擾素等,不僅不能分泌到細(xì)胞外,反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的直徑約為0.13.0m 的固體顆粒包含體。 12這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確, 而其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的,所以沒有生物活性。 因此,為獲得天然狀態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物,必須在分離回收包含體后,溶解包含體并設(shè)法使其中的目標(biāo)蛋白質(zhì)恢復(fù)應(yīng)有的天然構(gòu)象和活性。分子伴侶幫助變性蛋白質(zhì)正確折疊的功能為解決上述困難提供了可能。有些學(xué)者已成功地利用分子伴侶在體內(nèi)和體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。但分子伴侶在實(shí)際運(yùn)用中尚存在費(fèi)用高并需要與復(fù)性蛋白質(zhì)分離等缺點(diǎn),因此研究開發(fā)分子伴侶的重復(fù)利用性及穩(wěn)定性

17、是實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用的關(guān)鍵。董曉燕等利用固定化分子伴侶GroE,研究了其對(duì)變性溶菌酶的復(fù)性作用,解決了分子伴侶的重復(fù)利用問題。13Teshima 等利用固定化分子伴侶,在體外輔助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA 酶的折疊復(fù)性。14還有報(bào)道利用“小分子伴侶”對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性。 15它們能有效的促進(jìn)親環(huán)蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢桿菌RNA 酶的復(fù)性。由于小分子伴侶分子較小,更適合于固定化,且不需另加復(fù)性輔助因子(如GroES 和ATP等) , 因此具有很大的應(yīng)用前景。6. 2 分子伴侶的免疫保護(hù)作用分子伴侶不僅是胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、組裝與轉(zhuǎn)運(yùn)的幫助蛋白, 更令人驚奇的是它還可以成為感染性疾病中的免疫優(yōu)勢(shì)抗原,激發(fā)

18、宿主體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng),證實(shí)在細(xì)胞或寄生蟲感染中具有免疫保護(hù)作用。 16這說明分子伴侶有可能用作疫苗,來抵抗微生物的感染, 并用來治療腫瘤和自身免疫疾病17。用一個(gè)96ku的腫瘤相關(guān)分子伴侶免疫腫瘤病人,已進(jìn)入一期臨床實(shí)驗(yàn)。 18動(dòng)物疾病中的胰島素依賴型糖尿病、風(fēng)濕病等可被分子伴侶cpn60抑制,可能是cpn60-反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞起了作用。生理情況下,誘導(dǎo)熱休克蛋白Hsp70 等的過度表達(dá), 能使機(jī)體具有更高的缺血耐受能力, 減少急性成人呼吸窘迫癥造成的器官損害。6. 3 其他方面由于環(huán)境中無機(jī)及有機(jī)污染物對(duì) Hsp70有誘導(dǎo)作用, 因此可通過測(cè)定植物及動(dòng)物體內(nèi)的Hs

19、p70 水平來監(jiān)測(cè)環(huán)境污染情況。19另外, 研究表明, 隨著年齡增加, 人體血漿中的 Hsp60 和Hsp70明顯減少。20因此可通過測(cè)量血漿中熱休克蛋白和抗熱休克蛋白的抗體的水平來估計(jì)人體老化程度。7. 展望 盡管分子伴侶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能方面的研究取得了很大的進(jìn)展,但是DnaJ-likeHSC70 提供蛋白質(zhì)底物的機(jī)理,特別是對(duì)真核生物HSC70而言還不清楚;另外ATP 與HSP70 ATPase功能域的結(jié)合和水解引起的底物結(jié)合功能域構(gòu)象發(fā)生變化的機(jī)理仍然不知道。搞清楚這些問題,對(duì)于闡明蛋白質(zhì)的折疊、定位及跨膜運(yùn)輸機(jī)理和分子伴侶的實(shí)際應(yīng)用有重要意義。另外,研究開發(fā)分子伴侶的重復(fù)利用性及穩(wěn)定性

20、是實(shí)現(xiàn)分子伴侶實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵。參考文獻(xiàn)：1 王志珍.蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶J.生物學(xué)通報(bào),2004,39(5):1-5.2 劉慧萍, 柴玉波, 陳蘇民. 分子伴侶與疾病.3 李曉魯, 彭毅志. 熱激蛋白 70 與熱激反應(yīng)J . 生命的化學(xué), 2002, 22(2) : 145-147.4 Flaherty K M , Deluca - Flaherty C, McKay D B.Three dimensional structure of the ATPase fragment of a 70k heat shock cognate protein J . Nature,1990, 346(62

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