辛伐他汀對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)肽（PTHrP）誘導(dǎo)小鼠頭蓋骨骨吸收

1、辛伐他汀對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)肽（PTHrP）誘導(dǎo)小鼠頭蓋骨骨吸收的影響 作者：黃魯豫，胡蘊(yùn)玉 ，陶惠人，畢 龍，王 軍，范洪斌，費(fèi)正奇【關(guān)鍵詞】 辛伐他汀 摘 要：目的探討辛伐他汀對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞功能及對(duì)局部骨吸收的影響。方法采用甲狀旁腺素相關(guān)肽（parathyroid hormone related peptide,PTHrP）誘導(dǎo)的小鼠頭蓋骨骨吸收的動(dòng)物模型體系，分別采用皮下注射辛伐他汀（0、5、10、20 mgkg-1d-1）的方法，檢測(cè)頭蓋骨X線片的骨吸收面積，組織學(xué)用抗酒石炭酸染色（TRAP），檢測(cè)單位面積破骨細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果辛伐他汀在皮下注射（10、20 mgkg-1d-1）均可抑制頭蓋

2、骨的骨吸收和破骨細(xì)胞的形成，皮下注射（0、5 mgkg-1d-1）則無(wú)明顯的抑制作用。結(jié)論辛伐他汀對(duì)小鼠局部骨吸收有著明顯的抑制作用，對(duì)局部骨吸收的治療有著重要的意義。 關(guān)鍵詞：辛伐他汀; 甲狀旁腺素相關(guān)肽； 骨吸收； 動(dòng)物模型 Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of simvastatin on the osteoclast and the focal resorptin of calvaria boneMethodAnimal model of calvaria bone resorption was induced by parath

3、yroid hormonerelated peptide in miceResultSimvastatin on the dose of 10,20 mg/kg/d could inhibit the resorption of calvaria bone and the formation of osteoclast,while,no significant inhibition was observed on the low dose(0,5 mg/kd/d)ConclusionSimvastation can effectively inhibit the resorption of f

4、ocal bone in miceIt may provide an important strategy in treatment of diseases involved focal bone resorption Key words：Simvastatin; Parathyroid hormonerelated petide(PTHrP); Bone resorption; Animal model 他汀類藥由于抑制了膽固醇代謝中甲羥戊酸途徑的羥甲基戊二酰輔酶A(3HydroxyMethylglutary 1Coenzyme A，HMG CoA)還原酶活性，具有明顯的降血脂作用，目前是一

5、種廣泛應(yīng)用于臨床的降脂藥。1999年Mundy等1在篩選了3萬(wàn)多種化合物后發(fā)現(xiàn)，他汀類藥是唯一能促進(jìn)成骨細(xì)胞BMP2熒光報(bào)告基因活性的物質(zhì)。進(jìn)一步的研究表明他汀類藥可促進(jìn)成骨細(xì)胞系MC3T3E1及大鼠骨髓細(xì)胞的堿性磷酸酶活性和骨質(zhì)的礦化2、4，并且可促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠新骨的形成。在正常生理?xiàng)l件下骨吸收與骨形成處于動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)中，一旦這種平衡被打破將可能會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。破骨細(xì)胞是骨吸收的功能細(xì)胞，其吸收功能的亢進(jìn)與活躍在骨質(zhì)疏松中具有重要的意義。盡管以往有研究表明，他汀類藥可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá)來促進(jìn)骨生成，但其對(duì)正常成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能影響的報(bào)道甚少。本研究采用甲狀旁腺

6、素相關(guān)肽（PTHrP）誘導(dǎo)的小鼠頭蓋骨有吸收的動(dòng)物模型體系，探討辛伐他汀對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞骨吸收功能的作用及對(duì)局部骨吸收的影響。為闡明他汀類藥物對(duì)局部骨質(zhì)疏松的防治作用提供新的理論依據(jù)。 1 材料與方法 11 材 料 雄性4周齡BALB/C小鼠（購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心；清潔級(jí)二級(jí)），重組人PTHrP蛋白（美國(guó)GIBCO公司），辛伐他汀原料藥（simvastatin）(山東魯南制藥集團(tuán)提供，生產(chǎn)批號(hào)：050502)。 12 方 法 121 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn) 按甲狀旁腺素相關(guān)肽（PTHrP）誘導(dǎo)小鼠頭蓋骨骨吸收的動(dòng)物模型體系5，用Hamilton注射器，于小鼠頭顱頂部左側(cè)，每天注射PTHrP 2次，

7、共注射5 d，每次注射10 g/10 l，將小鼠共分為5組（每組7只）：組（治療對(duì)照組），于注射PTHrP前2 d開始皮下注射1%DMSO/生理鹽水50 l；、組（PTHrP+Simvastatin），分別于注射PTHrP前2 d開始皮下注射（5、10、20）mgkg-1d-1的1%DMSO/生理鹽水50 l，每天1次，共注射7 d；組（空白對(duì)照組），皮下注射蒸餾水10 l，每天2次，共注射5 d。24 h處死，取材。 小鼠處死后，采集顱骨標(biāo)本，使用Faxitron X線拍攝系統(tǒng)（型號(hào)43855，美國(guó)）拍攝X線片。用10%中性福爾馬林固定3 d，脫鈣48 h后，將顱骨前部沿冠狀縫，后部沿人字縫

8、切除，中間部分切成23 mm寬的小條，石蠟包埋，組織切片。切片作抗酒石酸染色后，再做HE染色。 122 骨吸收的定量分析 X線片用數(shù)碼照相機(jī)翻拍后，保存為JPG彩色格式，使用Leica QWin 23圖像分析軟件分析顱骨冠狀縫到人字縫之間骨吸收面積，閾值通過選取5個(gè)典型骨吸收部位的色彩強(qiáng)度來確定。 123 單位面積骨組織內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目 每個(gè)標(biāo)本取3張切片，做抗酒石炭酸染色（TRAP）后，再做HE染色?？拷墙M織且抗酒石炭酸染色陽(yáng)性的巨核細(xì)胞為破骨細(xì)胞。在Leico LA(德國(guó))全自動(dòng)顯微鏡和Pixaev數(shù)碼采集系統(tǒng)組成的圖像分析儀系統(tǒng)下采集圖像，分析自顱骨中縫向左側(cè)肌肉附著處（注射PTHrP的

9、一側(cè)）6個(gè)05mm05 mm區(qū)域內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目和骨面積，計(jì)算單位面積骨組織內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目（圖1） 圖1X線片種骨吸收的定量方法：使用Leica QWin 23圖像分析軟件，選用5個(gè)典型的骨吸收部位，測(cè)量其色彩強(qiáng)度后作為閾值，可以將骨吸收部位挑選出來，然后通過Leica QWin 23軟件自動(dòng)計(jì)算人字縫和冠狀縫之間的骨吸收面積124 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 10軟件系統(tǒng)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方法采用t檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 骨吸收X線片下定量分析 組（治療對(duì)照組），皮下注射PTHrP 2次/d，共注射5 d，每次注射10 g/10l，可形成明顯的露骨的骨吸收X線征象，組空白對(duì)照組則無(wú)顱骨的骨吸收征象；、組（P

10、THrP+Simvastatin）分別于皮下注射PTHrP前2 d開始皮下注射（10、20）mgkg-1d-1的1%DMSO生理鹽水50 l，每天1次，共注射7 d，其骨吸收面積及單位面積破骨細(xì)胞數(shù)目和組（治療對(duì)照組）相比均明顯減少；組于皮下注射PTHrP前2 d開始皮下注射5 mgkg-1d-1的1%DMSO生理鹽水50 l，每天1次，其骨吸收面積及單位面積破骨細(xì)胞數(shù)目和組（治療對(duì)照組）相比則無(wú)明顯減少（圖2、3，表1）。表1 注射PTHrp和Simvastatin后骨吸收面積與單位面積內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目 3 討 論 31 骨吸收性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的局部骨吸收動(dòng)物模型最初由Boyce BF等6人報(bào)告

11、，Boyce在小鼠顱骨注射IL1，3 d后顱骨有明顯的骨吸收，但11 d后，骨吸收部位又逐漸被新生的編織骨所填充。陶惠人5等注射PTHrP于小鼠顱骨，5 d后，產(chǎn)生明顯的骨吸收，并且較為穩(wěn)定，易于重復(fù)，是作者進(jìn)行骨質(zhì)疏松研究的良好的動(dòng)物模型。 32 自1999年發(fā)現(xiàn)辛伐他汀的骨促進(jìn)作用以來，大量的研究主要集中在對(duì)成骨細(xì)胞作用機(jī)制的研究，而辛伐他汀抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能的作用目前報(bào)道甚少，尤其是辛伐他汀對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞的作用目前尚未見報(bào)道。最近劉波等7人報(bào)告了利用體外培養(yǎng)的方法，辛伐他汀體外可明顯抑制大鼠顱骨破骨細(xì)胞骨吸收陷窩的形成以及培養(yǎng)上清鈣的釋放。Grasser WA8等研究表明洛伐他汀對(duì)體

12、外培養(yǎng)新生大鼠破骨細(xì)胞的形成和分化有著明顯的抑制作用，通過對(duì)甲二羥戊酸在破骨細(xì)胞發(fā)育代謝中作用的研究證實(shí)龍牛兒基龍牛兒醇在破骨細(xì)胞的形成和分化中起著重要作用。洛伐他汀對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用是通過關(guān)鍵異戊烯化蛋白的二牛龍牛兒基丙酮完成的，并且他汀類藥物骨效應(yīng)是影響局部破骨細(xì)胞數(shù)量的重要因素。大量研究發(fā)現(xiàn)9、10，IL6的抑制物MadindolineA(MDLA)與gp130（為IL6的功能性受體之一）結(jié)合后，IL6的活性受到抑制，破骨細(xì)胞的生成及去卵巢大鼠的骨丟失也顯著被抑制，從而證明IL6在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用。辛伐他汀可降低外周血單核細(xì)胞IL6的表達(dá)水平。尤其是在用藥的6周以后血中IL6的濃

13、度顯著降低。但是辛伐他汀對(duì)破骨細(xì)胞的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。Von knoch F等11人在2005年1月報(bào)告了大鼠口服120 mgkg-1d-1洛伐他汀可以抑制超高分子量的聚乙烯（UHMWPE）顆粒誘導(dǎo)的大鼠顱骨的骨吸收，并使局部破骨細(xì)胞數(shù)目減少。 圖2辛伐他汀治療小鼠顱骨骨吸收X線片：A對(duì)照組;B、C、D為不同劑量（5、10、20 mgkg-1d-1 scinjection）治療后的X線片 圖3aPTHrP誘導(dǎo)的骨吸收;b經(jīng)圖像處理軟件系統(tǒng)處理后，可自動(dòng)計(jì)算出骨面積、破骨細(xì)胞數(shù)目及單位面積骨組織內(nèi)的破骨細(xì)胞數(shù)目（Oc,N/TBA）33 他汀類藥物抗骨質(zhì)疏松有很大潛能，是目前發(fā)現(xiàn)的唯

14、一能夠既促進(jìn)骨形成，又抑制骨吸收的藥物，它通過很多途徑、多個(gè)環(huán)節(jié)來發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。本研究采用注射PTHrP誘導(dǎo)小鼠顱骨局部骨吸收模型體系，研究辛伐他汀對(duì)局部骨吸收的作用表明，辛伐他汀局部注射對(duì)局部骨吸收有著明顯的抑制作用，并存在著藥物的劑量依賴效應(yīng)。通過對(duì)局部破骨細(xì)胞數(shù)目的觀察，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對(duì)局部骨吸收的抑制作用，是和抑制局部破骨細(xì)胞的形成和分化有關(guān)的。他汀類藥物可以全身應(yīng)用有對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用，本研究為局部骨吸收疾病如內(nèi)固定松動(dòng)、關(guān)節(jié)假體的松動(dòng)等的預(yù)防和治療提供了局部治療的理論基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn)： 1 Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulati

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