膜片鉗記錄系統(tǒng)

1、膜片鉗記錄系統(tǒng)儀器簡介：膜片鉗技術是細胞電生理方面的高端技術，是研究細胞膜離子通道的重要工具。目前細胞膜離子通道的研究已經(jīng)應用到了藥物作用、環(huán)境對細胞膜離子通道的影響、神經(jīng)網(wǎng)絡研究以及疾病的診斷和治療等多個領域。膜片鉗技術是神經(jīng)科學、心血管、藥物學和藥效學、功能基因組學和許多遺傳病深入研究的有力手段。儀器名稱：膜片鉗記錄分析系統(tǒng)主要設備：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置顯微鏡、倒置顯微鏡、NIR-DIC成像系統(tǒng)、水鏡頭、微操縱器、微電極拉制儀、拋光儀、振動切片機等。儀器功能及應用范圍：單細胞膜片鉗記錄（急性分離細胞、培養(yǎng)細胞）、腦片膜片鉗記錄（盲法、可視法）收費標準：培訓費： 1

2、個月以內(nèi)500元；13個月1000元。 指導操作：院內(nèi)20元/小時，院外40元/小時。獨立操作：院內(nèi)60元/天，院外120元/天（由兩位指導老師認可培訓合格，方可進行獨立操作）。開放時間：周一至周五管理規(guī)定： 膜片鉗記錄分析系統(tǒng)屬于高端精密儀器，因此任何進入本室進行膜片鉗實驗的人員，必須經(jīng)過本室專門人員培訓合格認可后，經(jīng)允許方可進行膜片鉗放大器、微操縱器、拉制儀、切片機、顯微鏡等儀器的操作。 在實驗過程中，必須嚴格按照實驗流程進行操作，不得擅自更改操作步驟，不許自行調(diào)改儀器設置，以免造成儀器毀損。 儀器損壞賠償事宜按照我室賠償制度進行處理。 統(tǒng)一安排實驗時間，使用儀器后作登記。 實驗人員負責當

3、天的水電安全和室內(nèi)衛(wèi)生。腦片膜片鉗實驗流程(PC-2B)一、腦片制作1. 配制新鮮蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室溫，2025°C）各1L。2. 用丙酮浸泡刀片30 min。3. 麻醉動物：爪蟾MS-222，大鼠烏拉坦。4. 解剖動物，取腦組織。5. 切片：根據(jù)不同的動物和組織選擇不同的方案。方案一：低熔點瓊脂包埋組織后進行切片。方案二：普通瓊脂作托進行切片。6. 處理腦片：蔗糖溶液中4060min（4°C或32°C）。7. 孵育腦片：NaCl溶液中放置0.51h（室溫）后可進行膜片鉗實驗。注：腦片制作過程需全程通入95%O2+5%CO2混合氣。二

4、、全細胞膜片鉗記錄（一）盲法1. 將腦片置于灌流槽內(nèi)，用銀絲壓牢，并確保灌流系統(tǒng)通暢、穩(wěn)定。2. 雙手接觸屏蔽罩以釋放操作者身體靜電。3. 打開放大器POWERON，記錄模式選擇SEARCH檔。4. 打開IBBpatch-clamp軟件，點擊 按鈕，監(jiān)測電流及電阻變化。5. 系統(tǒng)holding選擇 -50 -80mV。6. 安裝玻璃微電極。7. 用注射器給電極內(nèi)施加適度正壓。8. 降低電極入水，并接近腦片。9. 封接：用微操縱器推動電極接觸腦片，并逐漸向腦片深處推進，當電阻突然增大，電流降低1/3以上時，釋放注射器內(nèi)正壓，緩慢抽吸，逐漸形成千兆歐姆封接（gigohm）。10. 破膜：輕拉注射器

5、，突然出現(xiàn)大的電容電流，表明已破膜，Whole-cell 模式形成。11. 迅速點擊 按鈕，記錄模式選擇VC檔。12. 點擊 按鈕，可觀察電流變化，但是不記錄、不保存。點擊 按鈕，可觀察并保存電流變化。（二）可視法基本步驟同盲法，不同的是需要在步驟8之前打開監(jiān)視器的DVCView軟件，在水鏡頭下找到目的細胞后再將電極入水，逐漸接近腦片直至到達該細胞，在可視的情況下完成后續(xù)步驟。單細胞膜片鉗實驗流程(AXON200B)一、單細胞急性分離一般過程為：解剖切片孵育消化洗酶吹打細胞貼壁。以急性分離大鼠海馬神經(jīng)元為例敘述如下：1. 配制人工腦脊液(ACSF) 250ml。2. 解剖：斷頭取腦，在冰冷（0

6、4°C）ACSF中取出海馬。3. 切片：將海馬沿矢狀位切成400600m厚的腦片。4. 孵育：腦片在ACSF中室溫下孵育50min。5. 消化：將孵育后的腦片移入酶消化液中，32°C消化25min。6. 洗酶：用ACSF洗腦片3次。7. 吹打：依次用口徑遞減的三個吸管輕輕吹打腦片，制成單細胞懸液。8. 貼壁：將單細胞懸液豎直靜置5min，吸取上方細胞懸液加到培養(yǎng)皿中，約30min后細胞貼壁，即可進行膜片鉗實驗。注：細胞急性分離過程需全程通入95%O2+5%CO2混合氣。二、全細胞膜片鉗記錄：單細胞膜片鉗實驗需要在倒置顯微鏡下進行，其步驟與腦片膜片鉗記錄過程基本相同。由于可直

7、接看到細胞，故可以將微電極直接接近并接觸目的細胞，完成封接、破膜等一系列過程。軟件設置和放大器操作不同之處主要有以下幾點：1. 按下放大器POWER，記錄模式選擇Vm檔2. 進入記錄軟件：開機后按F8鍵進入MS-DOS系統(tǒng) 輸入“cd pclamp6”命令 輸入“clampex / fetchex”進入記錄界面。3. File選擇預先設定好的刺激參數(shù)。4. Trial TestSeal 監(jiān)測電流變化，進行封接和破膜，形成全細胞模式。5. 記錄模式選擇VTRACK檔6. Trial View 觀察電流變化，但是不記錄、不保存。7. Trial Record可觀察并保存電流變化。拉制儀操作流程采用兩步法拉制玻璃微電極：1. 打開電源POWER(-)，預熱10min。2. 調(diào)節(jié)拉制參數(shù)。第1步拉制參數(shù)：將左側旋鈕旋置NO.1 HEATER，再旋轉(zhuǎn)右側第一個旋鈕NO.1 HEATER ADJ，調(diào)到所需參數(shù)。第2步拉制參數(shù)：將左側旋鈕旋置NO.2 HEATER，再旋轉(zhuǎn)右側第二個旋鈕NO.2 HEATER ADJ，調(diào)到所需參數(shù)。注：調(diào)節(jié)參