第一步分離菌

1、紅樹林海洋細菌的分離實驗材料：分離培養(yǎng)基1. M1培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.25%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，甘油磷酸鈉0.01%，瓊脂粉2.0%，人工海水1L，pH值7.27.42. 2216E培養(yǎng)基：Yeast extract 1g，Peptone 5g，F(xiàn)ePO4 0.01g，Agar 20g，人工海水1L， pH值7.27.43. 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，人工海水1L，pH值7.27.44.稱量（除瓊脂外的藥品）溶化調(diào)pH值加入瓊脂分裝滅菌（121,20min）倒平板實驗步驟： 1 樣品處理海泥：用50ml無菌人工海水將5g左右的海泥無

2、菌制作成均勻的懸濁液，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。樹根樹皮：分別取4g左右的樹皮和樹根，先用流動的清水沖洗干凈,再超聲清洗徹底去除植物組織表面的雜質(zhì), 然后進行嚴格的表面消毒程序，樣品依次用30%的過氧化氫浸泡5 min,無菌水清洗3次, 75%酒精浸泡3min, 無菌水清洗3次, 用濾紙吸干多余的水分，在超靜臺將其剪成小段，研磨，然后加入到40ml無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。2樣品稀釋液的制備分別吸取500µl處理好的各種海泥、樹根及樹皮等樣品的樣液，注入盛有4.5ml，無菌人工海水的小試管中，吹吸多次，使充分混勻，然后從

3、此小試管吸取500µl樣液注入另一支盛有4.5ml無菌人工海水的小試管中，以此類推，制成10-3,10-4,10-5各種稀釋度的樣液。2 細菌的分離培養(yǎng)吸取100µl稀釋為10-3,10-4,10-5稀釋度的樣液涂布在M1培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于分離細菌，并注明稀釋度。放于培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，28,23d。3記錄分離到的單菌落。紅樹林海洋放線菌的分離實驗材料：分離培養(yǎng)基1 改良高氏1號瓊脂培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂20g，重鉻酸鉀0.025

4、g，青霉素鈉0.002g，人工海水1000ml，pH7.27.4，121滅菌30分鐘。2 改良的HV培養(yǎng)基淀粉1g，硝酸鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.5g，氯化鉀1.7g，MgSO47H2O 0.05g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，碳酸鈣0.02g，硫胺素0.5mg，核黃素0.5mg，肌醇0.5mg，生物素0.25mg，維生素B6 0.5mg，煙酸0.5mg，瓊脂20g，重鉻酸鉀0.025g，青霉素鈉0.002g，人工海水1L，pH值7.27.4, 121滅菌30分鐘3 改良的GA培養(yǎng)基葡萄糖10g，牛肉膏1g，磷酸氫二鉀0.5g，瓊脂20g，重鉻酸鉀0.025g，青霉素鈉0.002g，人工海

5、水1L，pH值7.27.4,115滅菌30分鐘5. Waksman蛋清蛋白培養(yǎng)基蛋清蛋白0.25g(用0.1N NaOH數(shù)毫升溶解)，瓊脂20g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，MgSO47H2O 0.2g，葡萄糖1g，重鉻酸鉀0.025g，青霉素鈉0.002g，人工海水1000ml，pH值6.87.0，121滅菌30分鐘實驗步驟 51 樣品預處理 樣品懸浮液的直接制備 海泥：用50ml無菌人工海水將5g左右的海泥無菌制作成均勻的懸濁液，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。樹根樹皮：分別取4g左右的樹皮和樹根，先用流動的清水沖洗干凈,再超聲清洗徹底去除植物組織表面的雜質(zhì), 然后進

6、行嚴格的表面消毒程序，樣品依次用30%的過氧化氫浸泡5 min,無菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 無菌水清洗3次, 用濾紙吸干多余的水分，在超靜臺將其剪成小段，研磨，然后加入到40ml無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。SDS法處理 分別稱取2g樣品(根和皮用無菌剪刀剪碎)，加到20ml含有0.05%的SDS（5mmol/L磷酸鹽緩沖液配制）和6%酵母膏的無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用CaCl2法處理 分別稱取2g樣品(根和皮用無菌剪刀剪碎)，加到20ml含有1g/L氯化鈣的無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,2

7、00r/min)，備用苯酚法處理 分別稱取2g樣品(根和皮用無菌剪刀剪碎)，加到20ml含有1.5%苯酚的無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用濕熱法處理 取直接制備好的樣品懸浮液10ml55水浴6min，備用2 稀釋涂布a.用移液槍吸取500µl處理好的樣品懸浮液，注入另一盛有4.5ml無菌海水的小試管中，依次制成10-3,10-4,10-5稀釋液，然后吸取各100µl到改良高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并注明稀釋度。b. 用移液槍吸取500µl經(jīng)SDS處理的樣液，制成10-3,10-4,10-5稀釋液，然后

8、吸取各100µl到HV培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、Waksman蛋清蛋白培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并注明稀釋度。c. 用移液槍吸取500µl經(jīng)CaCl2處理的樣液，制成10-3,10-4,10-5稀釋液，然后吸取各100µl到HV培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、Waksman蛋清蛋白培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并注明稀釋度。d. 用移液槍吸取500µl經(jīng)苯酚處理的樣液，制成10-3,10-4,10-5稀釋液，然后吸取各100µl到HV培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、Waksman蛋清蛋白培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并注明

9、稀釋度。e. 用移液槍吸取500µl經(jīng)濕熱處理的樣液，制成10-3,10-4,10-5稀釋液，然后吸取各100µl到HV培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、Waksman蛋清蛋白培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，并注明稀釋度。3.培養(yǎng)將涂布好的培養(yǎng)皿28恒溫培養(yǎng)，第二、七、十四天觀察，34周可挑菌4純培養(yǎng)及時將選定的單菌落接入改良高氏1號瓊脂平板培養(yǎng)基，進行劃線分離培養(yǎng)。5形態(tài)分群 記錄菌落特征和培養(yǎng)特征紅樹林海洋真菌的分離實驗材料 分離培養(yǎng)基 1改良的Martin培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨（魚）5g，磷酸二氫鉀1g，新鮮的松樹針葉200g，MgSO47H2O 0.5g，瓊脂

10、20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121滅菌30分鐘2PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，瓊脂20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121滅菌30分鐘3察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，氯化鉀0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121滅菌30分鐘注：新鮮的松樹針葉加水800ml，煮沸1h，雙層紗布過濾，棄沉淀，加入含0.1g高錳酸鉀的水溶液20ml。實驗步驟1 樣品處理海水：海水樣品用無菌的0.45µm孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾海水，濾膜備用。海泥：用50

11、ml無菌人工海水將5g左右的海泥無菌制作成均勻的懸濁液，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。樹根樹皮：分別取4g左右的樹皮和樹根，先用流動的清水沖洗干凈,再超聲清洗徹底去除植物組織表面的雜質(zhì), 然后進行嚴格的表面消毒程序，樣品依次用30%的過氧化氫浸泡5 min,無菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 無菌水清洗3次, 用濾紙吸干多余的水分，在超靜臺將其剪成小段，研磨，然后加入到40ml無菌人工海水中，搖床振蕩0.5h(28,200r/min)，備用。海泥浸液的制備：取泥樣2g研磨，用人工海水做10倍稀釋，搖床振蕩1h(28,200r/min)，取出用6層紗布過濾，濾液滅

12、菌，備用。植物組織浸液的制備：取根皮各5g用自來水沖洗，再用人工海水清洗、剪碎、研磨，用人工海水做10倍稀釋，搖床振蕩1h(28,200r/min)，取出用6層紗布過濾，濾液滅菌，備用。2樣品稀釋液的制備分別吸取500µl處理好的各種海泥、樹根及樹皮等樣品的樣液，注入盛有4.5ml，無菌人工海水的小試管中，吹吸多次，使充分混勻，然后從此小試管吸取500µl樣液注入另一支盛有4.5ml無菌人工海水的小試管中，以此類推，制成10-1,10-2,10-3各種稀釋度的樣液。2 涂布培養(yǎng) a.濾膜直接鋪在Martin培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基上b.吸取海泥樣液100µl到Martin培養(yǎng)基、P