蛋白質(zhì)的分離與純化txt

1、蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離純化的基本流程 選擇材料和預(yù)處理 細胞的破碎及細胞器的分離 蛋白質(zhì)的抽提 蛋白質(zhì)的純化 濃縮、干燥和保存一、材料的選擇和預(yù)處理 微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定。 從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。 對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先除去結(jié)締組織和脂肪組織。 對預(yù)處理好的材料，若不立即進行實驗， 應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。二、細胞的破碎（一）機械方法：主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。 高速組織搗碎機（轉(zhuǎn)速可達10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動的

2、鋒利的刀片），適用于動物內(nèi)臟組織的破碎。 玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料；也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細胞破碎程度比高速搗碎機高，機械切力對分子破壞較小。 小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。（二）物理方法：主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎。 反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。 超聲波法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料；只要有設(shè)備，該法方便且效果也好，但一

3、次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時宜慎重。 （三）化學(xué)及生物化學(xué)法 有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等使細胞膜破壞； 細菌細胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果更好。此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。 細胞器的分離 制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料， 或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內(nèi)各組分先行分離，以便于獲得更好的分離效果。 細胞器的分離一般采用差速離心法 細胞經(jīng)過破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進行差速離心。利用細胞

4、各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。 細胞器的分離制備，介質(zhì)的選擇現(xiàn)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。三、蛋白質(zhì)的提取 提取是將經(jīng)過預(yù)處理或破碎了的細胞或組織置于一定條件下的溶劑中，讓被提取的蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)充分地釋放出來，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過程。 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)。 抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。 膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑，

5、使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。 在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。水溶液提取法 大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。 注意事項 溫度：一般采用低溫（4以下）操作 鹽濃度：等滲鹽溶液以0.020.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用；0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。 pH：提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH 范圍有機溶劑提取法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙

6、酮和丁醇等有機溶劑提??；這些有機溶劑具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的脂蛋白提取液。 必須在低溫下操作。 丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越 丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強。 丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。 丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。 表面活性劑的利用 對于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，可以采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。 表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐溫6

7、0 及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。 對提取物的保護 無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使生物大分子降解，導(dǎo)致天然產(chǎn)物的量減少。 二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用； 碘乙酸可以抑制活性中心有巰基的蛋白水解酶的活性 苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力 還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使反應(yīng)條件適合于目的蛋白的提取。 四、蛋白質(zhì)的純化 做純化前應(yīng)做的工作： 了解目標(biāo)物質(zhì)的特性 必須建立可靠的活性測定的方法 純化流程 蛋白質(zhì)的粗提純 純化 純度鑒定 活性測定（一）蛋白質(zhì)的粗提純 選用適當(dāng)?shù)?/p>

8、方法將所要的蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。 常用方法：鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀法鹽析法 向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析。 由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素 溫度：一般室溫操作，對溫度敏感的蛋白可在低溫下操作。 pH：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低。 蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的

9、蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。 鹽析中常用的中性鹽：硫酸銨 鹽析后除鹽的方法：常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行；也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。 等電點沉淀法 蛋白質(zhì)在表面靜電荷為零狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，利用各種蛋白質(zhì)等電點的差別，可通過調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結(jié)合用。低溫有機溶劑沉淀法 有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低

10、；有機溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中沉淀析出。 常用的有機溶劑是乙醇和丙酮，一般宜在低溫下進行，且在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以免局部濃度過大。（二）蛋白質(zhì)粗品的純化 常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。 通常幾種方法聯(lián)合使用來獲得較高純度的蛋白質(zhì)樣品。 凝膠過濾（分子篩） 是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作分離介質(zhì)，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同對混合物進行分離的技術(shù)。 層析柱中的填料是某些惰性的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，流下來速度慢，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，流下來的速度快

11、，當(dāng)混合物通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同的分子量篩分開了。凝膠過濾的優(yōu)點 所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷， 吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對待分離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。凝膠過濾的基本實驗流程 凝膠的選擇 凝膠的預(yù)處理 裝柱 層析柱的選擇，填裝的注意事項，平衡，使用前的檢查 上樣及洗脫 樣品的預(yù)處理 凝膠柱的重復(fù)使用，凝膠的回收和保存 凝膠層析的應(yīng)用 脫鹽 分離提純 測定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一種組分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量

12、的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時，可將此樣品加在測定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。 高分子溶液的濃縮：SephadexG-25或G-50干膠。 離子交換層析 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography）是以離子交換劑為固定相， 依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。 常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。 離子交換層析中，基質(zhì)是由帶電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換劑

13、，帶有負(fù)電荷的稱之陽離子交換劑。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下時，其所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)目都會不同。 陰離子交換劑可以結(jié)合帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。 陽離子交換劑結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白也可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。離子交換層析的基本實驗流程 離子交換劑的選擇和預(yù)處理 裝柱 層析柱的選擇，填裝的注意事項，平衡 上樣及洗脫 階段洗脫 梯度洗脫 離子交換劑的再生和保存 離子交換層析的應(yīng)用 在生物化學(xué)及臨床生化檢驗中主要用于分離氨基酸、多肽

14、及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。 親和層析 在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗原與抗體的識別結(jié)合等，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的， 改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。 將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中；那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開；然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘海?改變結(jié)合條件，將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白

15、質(zhì)的方法稱為親和層析。親和層析配基的選擇 某些生物分子可與層析載體相偶聯(lián)制成親和吸附劑，在一定條件下，這些分子能與待分離的生物分子（如蛋白質(zhì)）進行專一結(jié)合，在適當(dāng)條件下又可重新解離，這些生物分子就叫配基。 配基可以是較小的分子，如輔酶、輔基、變構(gòu)酶的效應(yīng)劑，也可以是大分子，如抗體、酶的抑制劑。 親和層析中配基應(yīng)具備的條件 在一定條件下，能和待分離的生物大分子進行專一結(jié)合，且親和力越大越好； 配基和生物大分子結(jié)合后，在一定條件下又能解離，且不能破壞生物大分子的生物活性； 配基上必須含有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團，以便用化學(xué)方法將其偶聯(lián)到載體上，偶聯(lián)后不致影響配基和待分離物質(zhì)的專一結(jié)合。 在親和層析中，配基選

16、擇是否合適是實驗成敗的關(guān)鍵。 一般來說，根據(jù)待分離的生物大分子在溶液中與一些物質(zhì)作用親和力的大小和專一性進行選擇。 大多數(shù)情況下，理想的配基要做大量的實驗進行篩選。載體的選擇 一般為凝膠 理想的載體應(yīng)具備的條件 不溶于水，但高度親水； 惰性物質(zhì)，非特異性吸附少 具有相當(dāng)數(shù)量的化學(xué)基團可供活化； 理化性質(zhì)穩(wěn)定； 機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速； 通透性好，最好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過。 常用載體 瓊脂糖凝膠親水性強，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時，對蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸附，極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)

17、穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，易于再生和反復(fù)使用。 瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時分別稱為2B、4B、6B。因為Sepharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B 大，所以4B應(yīng)用最廣。 親和吸附劑的制備 載體的活化 配基與活化載體偶聯(lián) 由于載體性質(zhì)不同，活化及偶聯(lián)的方法也有差異。 親和層析的基本實驗流程 吸附 使上柱樣品和親和吸附劑在柱內(nèi)接觸一定時間，保證兩者之間充分起作用。 洗脫 改變pH、離子強度或緩沖液的組成 親和吸附劑的再生 疏水層析 它利用蛋白質(zhì)表面有一部分疏水性， 與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結(jié)合。洗脫時將鹽濃度逐漸降低，蛋白質(zhì)因

18、疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化。 此法能分離其它一些方法不易純化的蛋白質(zhì)。 （三）純度鑒定 蛋白質(zhì)提純以后需要有指標(biāo)來說明它的純度，從原則上看許多純化蛋白質(zhì)的方法也可以將它們改成純度分析方法。 由于蛋白質(zhì)數(shù)量多，性質(zhì)相似者在所難免，一個條件下兩種蛋白質(zhì)不能分開的可能性很大，一般均希望用兩種以上的方法來分析蛋白質(zhì)的純度。只有一種檢定方法時應(yīng)該用兩種以上條件來鑒定。 對蛋白質(zhì)純度的要求因工作需要而異，生物制品考慮制品在體內(nèi)的副作用，物理化學(xué)研究要求不干擾對象的物化性質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)分析要示雜質(zhì)含量低于分析方法的靈敏度等。 確定蛋白質(zhì)（或多肽）樣品的純度標(biāo)準(zhǔn)大致如下：分子大小是否均一，電荷是否均一，

19、是否具有恒定的氨基酸組成，是否具有單一的N末端和C末端殘基，進一步純化時生物活性是否再有提高及能否結(jié)晶等。 通常以電泳時呈現(xiàn)一條帶以及末端殘基鑒定是單一的即可進行順序測定。 純度鑒定的常用方法 PAGE SDS-PAGE 等點聚焦電泳 N-末端氨基酸分析 HPLC （四）蛋白質(zhì)含量測定 總蛋白含量測定（mg/ml）：單位體積溶液中所含蛋白質(zhì)的量。常用方法有Folin-酚試劑法、Biored染色法等。 某一特定蛋白含量的測定（IU/ml）：單位體積溶液中所含的該種蛋白質(zhì)活性單位數(shù)。根據(jù)蛋白質(zhì)的自身特點進行定義，建立相應(yīng)的檢測方法。 蛋白質(zhì)的比活性（IU/mg）：單位質(zhì)量蛋白質(zhì)分子中所含的蛋白質(zhì)活

20、性單位數(shù)。 活性測定貫穿于蛋白質(zhì)提取和分離純化的整個過程，通過活性分析和純度鑒定跟蹤目標(biāo)蛋白，指導(dǎo)整個分離純化工作。 五、蛋白質(zhì)的濃縮、干燥和保存（一）樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化使樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法 減壓濃縮：通過降低液面壓力使液體沸點降低， 液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快。此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。 空氣流動蒸發(fā)濃縮：將生物大分子溶液裝入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不斷蒸發(fā)，而達到濃縮目的。 冰凍法：生物大分子溶液在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內(nèi)而留在液相中。先將待濃縮的溶液冷卻使之變

21、成固體，然后緩慢融解，利用溶劑與溶質(zhì)溶解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。 吸收法：通過吸收劑直接吸收除去溶液中溶劑分子使之濃縮。吸收劑必須不與溶液起化學(xué)反應(yīng)， 對生物大分子不吸附，易與溶液分開。聚乙二醇 超濾法：使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法，液體在一定壓力下通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留。最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值等參數(shù)均不同， 必須根據(jù)工作需要來選用。 （二）樣品的干燥生物大分子制備得到的產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要