汞中毒大鼠脊髓GFAP表達與藥物干預(yù)研究

1、    汞中毒大鼠脊髓GFAP表達與藥物干預(yù)研究            作者：周永田，徐旭東，劉正時間：2007-11-22 11:40:00                          

2、60;     作者：侯殿東，施麗飛，張韻，孫衛(wèi)民，滕文鋒，劉輝 【關(guān)鍵詞】  汞中毒；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓；,星形膠質(zhì)細胞；膠質(zhì)纖維酸性蛋白摘要： 目的  觀察HgCl2對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的影響。方法  SD大鼠30只,雌雄各半，體重160200g。隨機分為3組，每組10只。大劑量組按17mg/kg（1/4 LD50）經(jīng)口灌胃HgCl2溶液，1次/d。小劑量組按85mg/kg（1/8 LD50）經(jīng)口灌胃HgCl2溶液，1次/d。對照組經(jīng)口灌胃生理鹽水2ml，1次/d，3組均連續(xù)灌胃（20±2）d。染汞組建成亞

3、急性汞中毒模型后，各組均處死5只雄鼠，留5只雌鼠作藥物干預(yù)試驗。染汞組用二巰丙磺鈉注射液（DMPS）按28mg/kg腹腔注射驅(qū)汞2個療程，小劑量組僅用DMPS,大劑量組在用DMPS的期間內(nèi)，按2922/(kgd)經(jīng)口灌胃己酮可可堿（ POF）溶液14d。實驗結(jié)束后處死全部動物，灌注固定取出脊髓L5-6節(jié)并制成病理切片。用免疫組化鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶聚合物（SABC）法測定脊髓膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。結(jié)果   大、小劑量組GFAP平均灰度均顯著低于對照組,陽性細胞率均顯著高于對照組。DMPS+POF顯著降低GFAP陽性細胞率，提高平均灰度值，單純應(yīng)用DMPS無

4、此作用。結(jié)論  亞急性HgCl2中毒大鼠脊髓GFAP表達上調(diào)，POF能夠有效抑制星形膠質(zhì)細胞激活。關(guān)鍵詞：汞中毒；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓； 星形膠質(zhì)細胞；膠質(zhì)纖維酸性蛋白Study on spinal cord GFAP of mecury poisoning rat and drug trial  Abstract： Objective  To observe the effect of  HgCl2 on the astrocyte in spinal cord.Methods  Thirty SD rats(15,15,weighting

5、160200g) were randomized into 3 groups of 10(5,5)each. Group A and group B received HgCl2 juice at a dose of 17mg/kg(1/4 LD50),8.5 mg/kg(1/8 LD50) respectively by gavage daily . Group C  received 0.9% saline 2 ml by gavage daily.To found the sub-acute mercury poisoning rat model within(20±

6、2) days.Then male rats in each group were dissected and the chelator( DMPS) was injected into the abdomen of female rats of group A and B  at a dose of 28 mg/kg for 2 periods .Group A received DMPS+POF(pentoxifylline) and group B received DMPS only.The POF was used at a dose of 29.22 mg/kg by g

7、avage daily for 14 days .The rats were all dissected and the spinal cord (L5-6) were gotten after the trial finished.Then the pathological section of spinal cord was made from and GFAP was detected .Results  The average gray scale in group A and group B are all less and the positive cell rate&#

8、160; are all larger significantly compaired with control group.The POF depress the activation of astrocyte significantly.Conclusion  Sub-acute poisoning of HgCl2 enhance GFAP level  significantly in spinal cord,and POF depresses the activation of astrocyte.Key words：mercury poisoning；neuro

9、pathic pain；spinal cord；astrocyte；glial fibrillary acidic protein(GFAP)    目前職業(yè)病臨床治療汞中毒主要應(yīng)用螯合劑療法，以驅(qū)汞為主，輔以對癥治療。但對汞中毒疼痛缺乏有效治療措施。許多患者即使驅(qū)汞多個療程，而疼痛依然頑固如初。為了探索汞中毒疼痛的發(fā)病機制，尋找有效鎮(zhèn)痛方法，進行本項研究。結(jié)果報告如下。1  材料與方法11  實驗動物  健康SD大鼠30只,雌雄各半，體重160200g（上海希蒲爾必凱實驗動物有限公司）。按雌雄分開，每籠5只。本院動物房飼養(yǎng)，自由攝食

10、飲水。為排除針刺、抓撓、經(jīng)口灌胃等多種因素對大鼠脊髓GFAP表達的影響，設(shè)立對照組。分組染汞，將動物隨機分為3組，每組10只，雌雄各5只。大劑量組按17mg/kg（1/4 LD50）、小劑量組按85mg/kg（1/8 LD50）經(jīng)口灌胃HgCl2溶液，1次/d；對照組經(jīng)口灌胃生理鹽水2ml，1次/d。3組均連續(xù)灌胃（20±2）d，將染汞組制成亞急性汞中毒模型。12  汞中毒判斷標準  動物出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，行動障礙或痙攣1。疼痛判斷標準：動物出現(xiàn)抓舔肢體、甩尾、嘶叫、翻身、轉(zhuǎn)圈等表現(xiàn)2。超過50%的動物出現(xiàn)中毒癥狀后停止染汞，判定為造模成功。13  藥物干預(yù)

11、  造模成功后各組均處死5只雄鼠，留5只雌鼠作藥物干預(yù)試驗。小劑量染汞組用二巰丙磺鈉注射液（DMPS），按28mg/kg腹腔注射驅(qū)汞2個療程（驅(qū)3d，休4d為1個療程），驅(qū)汞期間經(jīng)口灌胃生理鹽水1ml/d，送胃14d。大劑量染汞組用同樣方法驅(qū)汞，在驅(qū)汞期間用己酮可可堿 (POF)溶液按2922mg/(kgd)經(jīng)口灌胃，14d。對照組腹腔注射生理鹽水1ml/d，注射3d，休息4d為1個周期，共注射2個周期，在此期間經(jīng)口灌胃生理鹽水1ml/次，共14d。實驗結(jié)束后處死全部動物。14  動物處死與取材方法  用1%戊巴比妥鈉，按40mg/kg腹腔注射麻醉動物,隨后將其固

12、定于解剖臺上,剖胸做心臟穿刺,將針頭固定于升主動脈,先灌注生理鹽水約150ml，再灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH74)約200ml 。待動物僵硬后取出脊髓L5-6節(jié)，置于10%的甲醛磷酸緩沖液中固定,按常規(guī)制成病理切片。15  檢測項目、試劑與儀器  實驗用HgCl2(上?；瘜W(xué)試劑總廠)分析純度為9999%，生產(chǎn)批號為990402；DMPS(上海禾豐制藥有限公司)生產(chǎn)批號為0309011；POF(德國Merckle GmbH藥業(yè)公司) 生產(chǎn)批號為C20571；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)試劑盒(武漢博生微生

13、物工程有限公司)編號為SA1025；微量白蛋白（mALB）檢測試劑盒(伊利康生物技術(shù)有限公司)生產(chǎn)批號為040902。 用Z-5000原子吸收光譜儀(日本日立電子有限公司)按冷原子吸收法測定尿汞；用CHEMISTRY ANALYZER  RT1904C半自動生化分析儀按免疫透射比濁法3測定尿微量白蛋白；用免疫組化鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶聚合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC) 法3測定脊髓GFAP。按照試劑盒說明書操作，用400倍光學(xué)顯微鏡觀察并攝片，用LEICA  QWIN  V3 圖像分析軟件對病理

14、切片進行分析?；叶葴y量：將切片中圖像通過攝像頭轉(zhuǎn)入計算機圖像分析系統(tǒng)，根據(jù)其顏色的深淺、陽性部分反應(yīng)強弱，判定灰度的大小?；叶确?56級，從0255級，0級最深，表示陽性反應(yīng)強；255最淺，表示陽性反應(yīng)弱。脊髓背角可以分成表層（層和層），中間層（和層），深層（V層和VI層），記數(shù)GFAP在整個背根的表達數(shù)。16  統(tǒng)計分析  將數(shù)據(jù)輸入Excel表格，用SPSS 100軟件進行分析，采用Homogeneity-of-variance進行方差齊性檢驗，若方差齊，則進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并采用Dunnett-test進行實驗組與對照組均數(shù)間兩兩比較；若方差不齊，則用Kruskal-Wallis test作非參數(shù)統(tǒng)計，用Mann-Whitney test進行均數(shù)間兩兩比較。= 005。2  結(jié)果21  動物染毒與中毒表現(xiàn)  大劑量組大鼠于染汞第12d時開始出現(xiàn)口腔流涎，口腔出現(xiàn)血性分泌物，精神萎靡，活動減少，