酶解大豆蛋白生產(chǎn)生物活性肽

1、酶解大豆蛋白生產(chǎn)生物活性肽游子娟 2013.3.18酶的選擇 動(dòng)物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等； 植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等； 微生物來源蛋白酶，如丹麥 Novo 公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶 Alcalase、復(fù)合蛋白酶 Protamex、中性蛋白酶 Neutrase 以及國產(chǎn)的堿性蛋白酶地衣型芽抱桿菌2709、中性蛋白酶枯草桿菌 1.398、放線菌 l66、棲土曲霉 3.942、酸性蛋白酶黑曲霉 3350等。一些蛋白酶的切割位點(diǎn)和較適 pH 值大豆肽的性質(zhì)與功能 （l）易消化、易吸收性 （2）低抗原性 低分子肽具有低的抗原性，不會(huì)引起過敏反應(yīng)，可為食物過敏

2、患者食用。（3）降膽固醇作用 大豆肽能刺激甲狀腺激素分泌，促使膽固醇代謝生成膽汁酸，膽汁酸又被食物纖維素所吸附排出體外，從而阻礙對(duì)膽固醇吸收，起到降低膽固醇的作用。（4）降血壓作用（5）減肥作用（6）抗疲勞、增強(qiáng)體力（7）抗氧化活性蛋白酶活力的測定方法 酶活力的定義為：1g 固體酶粉（或 1mL 液體酶），在一定溫度和 pH 條件下，lmin內(nèi)水解標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白產(chǎn)生 1g 酪氨酸，即為 1 個(gè)酶活力單位，以 U/g（U/mL）表示。 酶活測定方法為福林酚法。其原理為蛋白酶在一定的溫度與 pH 條件下，水解酪蛋白底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)

3、與鎢藍(lán)，用分光光度計(jì)于波長 680nm 下測定溶液的吸光度。因酶活力與吸光度成正比例，由此可以計(jì)算產(chǎn)品的酶活力。水解度的測定方法 大豆蛋白水解度（DH）是水解過程中所斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的比例，通常表示為百分?jǐn)?shù)的形式。肽鍵斷裂后生成多肽或氨基酸，-氨基氮含量增加，因此，水解度可根據(jù)水解過程中生成的 -氨基氮的數(shù)量得到按下式進(jìn)行計(jì)算： DH（%）（水解后生成的 -氨基氮的量/樣品總含氮量）100% 水解后生成的 -氨基氮的量由甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由凱氏定氮法測得 苦味評(píng)價(jià)方法 稱取奎啉 0.1g 溶于 50ml 5%乙醇溶液中，從中取 5ml 溶液用蒸餾水稀釋到100ml，得到 1.0

4、10-4奎啉溶液，再進(jìn)一步稀釋成 510-5、2.510-5、110-5、510-6等濃度奎啉溶液，其苦味值分別定為 10、5、2.5、1、0.5,將制得的大豆多肽與不同濃度奎啉溶液比較，從而確定大豆多肽的苦味值。大豆肽抗氧化性的研究 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，這類活性肽能抑制機(jī)體內(nèi)自由基的大量積累，對(duì)提高自由基清除機(jī)制起到一定功效。從而能在一定程度上消除機(jī)體內(nèi)多種生理功能的障礙，延緩機(jī)體的衰老，減少各種老年性疾病的發(fā)生。 生物抗氧化劑通常通過以下五種途徑來達(dá)到抗氧化目的：（1）抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。（2）直接清除活性氧自由基。（3）清除氧。（4）螯合金屬離子。（5）激活機(jī)體本

5、身內(nèi)在抗氧化防御系統(tǒng)。五種途徑實(shí)際上都是圍繞阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來進(jìn)行。由于過量自由基容易引發(fā)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致組織損傷的主要原因，所以研究抗氧化劑防止體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的能力就顯得特別重要.研究方法 1.采用亞油酸硫氰酸鉀體系、鄰苯三酚自氧化體系研究蛋白酶種類、水解方法、水解時(shí)間、水解度對(duì)水解物抗氧化活性的影響，確定獲得高抗氧化性水解物的方法。 2.采用 Sephadex G25 凝膠過濾層析將大豆分離蛋白的水解物按分子量大小分成不同部分，采用亞油酸硫氰酸鉀體系、鄰苯三酚自氧化體系和人紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)來研究水解液不同部分對(duì)抗氧化活性的影響。確定抗氧化性最高的大

6、豆肽的分子量范圍。 3采用高效凝膠過濾色譜對(duì)抗氧化活性較好的大豆肽段繼續(xù)進(jìn)行分離，進(jìn)一步確定抗氧化大豆肽的分子量分布范圍。亞油酸硫氰酸鉀方法 原理：通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)積累起來的大量過氧化脂質(zhì)將 Fe2+氧化生成Fe3+，F(xiàn)e3+和 SCN-結(jié)合，生成紅色硫氰酸鐵。大豆肽由于能夠清除自由基，從而阻斷或抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減少紅色硫氰酸鐵產(chǎn)生。因此通過比色反應(yīng)可以檢測大豆肽抗氧化性的強(qiáng)弱。 在 5ml 具塞玻璃試管加入 1.5ml.0.15mol/L（pH7）的磷酸鹽緩沖液，加入濃度 2待測大豆蛋白水解物樣品 100L，加入 100l 50mmol/L 亞油酸的乙醇溶液和 25l 50mmol/L 的 FeC

7、l2-EDTA 溶液，采用漩渦分散器振蕩后，蓋上玻蓋，于50暗處水浴保溫，記錄保溫時(shí)間。 大豆蛋白水解物抗氧化性檢測 另取一支普通試管，加入 3ml75%乙醇，100 l 上述混合液， 100 l 1mol/L 的 FeCl2的 1.0mol/LHCl 溶液，100l30%KSCN，采用漩渦分散器振蕩后，立即計(jì)時(shí)，三分鐘后用蒸餾水作參比，在480nm 處測定溶液的吸光度 A。以抗氧化劑空白的吸光度為 A0，加抗氧化劑時(shí)吸光度為 AS，抗氧化活力 AA（antioxidative activity）可用公式表示： 鄰苯三酚方法 原理：試驗(yàn)通過鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)產(chǎn)生 O2，研究大豆蛋白水解物對(duì)

8、O2的清除能力。鄰苯三酚的自氧化機(jī)理比較復(fù)雜，它在堿性條件下能迅速自氧化、釋放出 O2，生成黃色的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物的累積 3040s 后與時(shí)間成線性關(guān)系，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，可清除 O2，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致產(chǎn)物顏色較淺，采用分光光度計(jì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行比色分析，可以檢測該抗氧化劑清除O2自由基的能力。 步驟：在一系列的試管中加 3ml 0.05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)，分別加入濃度 2待測大豆肽樣品溶液 100l，空白組加入同體積蒸餾水，再加入 100l的 0.45mol/L 鄰苯三酚溶液，振蕩并計(jì)時(shí)，待計(jì)時(shí)至三分鐘時(shí)立即加入 100l 3%抗壞血酸溶液，振蕩，終止反應(yīng)，在 325nm 處測吸光度 A。以抗氧化劑空白的吸光度為 A0，加抗氧化劑時(shí)吸光度為 AS，清除自由基活力 SA（scavengingactivity）可用公式表示：存在的問題 與生產(chǎn)大豆蛋白相比，制備大豆肽需要增加一定量的設(shè)備和工藝程序，所以生產(chǎn)成本比較高，價(jià)格也比較高，這也是多肽類制品進(jìn)入市場較困難的主要原因 。 其次，將大豆蛋