細胞色素P450研究進展

1、1.1細胞色素P450研究進展1.1.1細胞色素P450細胞色素P450(cytochrome P450或CYP, 簡稱P450）是一個古老的以血紅素為輔基的B族細胞色素蛋白酶基因超家族，廣泛存在于細菌、真菌、植物以及動物等各種生物體內(nèi)1，通常與質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器膜結(jié)合。還原態(tài)P450與CO結(jié)合后在450nm處能檢測到最大吸收峰，故命名為P450。因其能使疏水性分子插入一個氧原子而變得更具有親水性或者活性，因此又稱之為單加氧酶(mixed-function oxidase, 簡稱MFO)2。P450酶系作為自然界中生物催化劑，它所催化的反應(yīng)類型多樣，最典型的反應(yīng)是把分子氧還

2、原為水的同時，將其中一個氧原子轉(zhuǎn)移至底物形成產(chǎn)物，催化反應(yīng)為3:RH+O2+NADPH+H+ ROH+H2O+NADP+1958年，在大鼠肝微粒體中第一次發(fā)現(xiàn)P450。D.S Frear于1969年首次在棉花(Gossypium hirsutum L.)中發(fā)現(xiàn)了它的存在4。此后，大量的研究表明在擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)5、小麥(Triticum aestivum L.)6、苜蓿(Medicago sativa L.)7、蓖麻(Ricinus communis L.)8等許多植物中也均有P450存在。P450酶系在植物中參與多種代謝反應(yīng)，發(fā)揮重要的催化作用。1 O

3、mura T (1999). Forty years of cytochrome P450. Biochem Biophys Res Commun, 266 (3): 690698.2 Nelson D R, Kaymans L, Kamataki T, et al. P450 superfamily:update on new sequence, gene mapping, accession numbers andnomenclature J. Pharmacogenetics, 1996, 6:1-42.3 Ortiz de Montellano PR. Cytochrome P450:

4、 structure, mechanism, and biochemistry M, 3rd ed. Kluwer Academic/Plenum Press, New York, 2005, 183-245.4 Frear DS, Swanson HR, Tanaka FS. N-Demethylation of substituted 3-(phenyl)-1-methylureas: isolation and characterization of a microsomal mixed function oxidase from cotton. Phytochemistry, 1969

5、, 8(11): 21572169.5 Paquette SM, Bak S, Feyereisen R. Intron-exon organization and phylogeny in a large superfamily, the paralogous cytochrome P450 genes of Arabidopsis thaliana. DNA Cell Biol, 2000, 19(5): 307317. 6 Murphy PJ, West CA. The role of mixed function oxidases in kaurene metabolism in Ec

6、hinocystis macrocarpa Greene endosperm. Arch Biochem Biophys, 1969, 133(2): 395407. 7 Li LY, Cheng H, Gai JY, Yu DY. Genome-wide identifycation and characterization of putative cytochrome P450 genes in the model legume Medicago truncatula. Planta, 2007, 226(1): 109123. 8 Lew FL, West CA. (-)-kaur-16

7、-en-7-ol-19-oic acid, an intermediate in gibberellin biosynthesis. Phytochemistry, 1971, 10(9): 20652076.1.1.2細胞色素P450結(jié)構(gòu)特征在細胞色素P450超基因家族中，不同成員之間在氨基酸序列上具有高度的變異性，但其空間結(jié)構(gòu)上卻保持較高的相似性，P450蛋白三級結(jié)構(gòu)主要由C端的-螺旋結(jié)構(gòu)和N端的-折疊結(jié)構(gòu)組成1,2。與半胱氨酸相連接的血紅素（heme）結(jié)合位點是諸多結(jié)構(gòu)域中最為保守的活性中心，其主要螺旋k、螺旋I、螺旋C和“曲”（meander）等重要的保守區(qū)域組成3，如表1所示。保守區(qū)

8、域Conserved domains特征序列Signature sequences區(qū)域特征Conserved characteristic血紅素結(jié)合域 Heme binding domainFxxGxRxCxG/A是鑒定P450的主要特征,位于血紅素近表面，含高度保守的半胱氨酸(cys)，提供亞鐵血紅素的第5個配體，亞鐵血紅素接受電子被還原后同CO結(jié)合，在450nm附近形成特征吸收峰。螺旋C Helix CWxxxR 是位于細胞色素P450 N端的保守序列，其中，色氨酸（Trp）和精氨酸（Arg）殘基與血紅素輔基丙酸負(fù)離子作用，與血紅素形成電子拉鏈。螺旋I Helix I(A/G)Gx(D/E

9、)T(T/S)含有高度保守的蘇氨酸（Thr），位于活性中心吡咯環(huán)B的上方，推測與氧分子或底物分子的結(jié)合有關(guān)。螺旋K Helix KExxR位于血紅素近側(cè)，谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg）完全保守，可能具有穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的作用。 曲 meanderFxPE/DRF 位于蛋白質(zhì)近表面，沒有特征性的二級結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守1 Chapple C. Molecular-genetic analysis of plant cytochrome p450-dependent monooxygenasesJ. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998

10、, 49:311.2 Rupasinghe S, Schuler MA. Homology modeling of plant cytochrome P450sJ. Phytochem Rev, 2006, 5(2-3):473.3 賀麗虹, 趙淑娟, 胡之璧, 2008, 植物細胞色素P450基因與功能研究進展, 藥物生物技術(shù), 15(2): 142-147.1.1.3細胞色素P450的分類與命名隨著越來越多的P450基因被識別和鑒定，為了方便研究和應(yīng)用，Nerbert等1在1987年提出根據(jù)基因編碼的氨基酸序列的相似度來劃分細胞色素P450的家族和亞家族，后逐漸形成了一套統(tǒng)一的命名系統(tǒng)：以

11、英文縮寫CYP代表細胞色素P450，CYP后第一個數(shù)字為家族編號，其后的大寫英文字母為亞家族編號，字母后的數(shù)字表示單個基因2。對某一新發(fā)現(xiàn)的P450基因進行命名時，看其與已知P450的氨基酸序列的一致性，若二者大于40%，則它們屬于同一個家族，否則該基因就屬于一個新的P450家族；若大于40%而小于55%，則屬于同一P450家族的兩個不同的亞家族；若大于55%，則屬于同一亞家族。同源性不小于97%的歸為等位基因3。植物P450可分為10個簇（clans），和47個家族。最大的一個簇被稱為A-type植物P450集團，又稱為71 clan，其余9個簇被稱為non-A-type植物P450集團4，

12、如表2所示。簇（Clan）家族（family）A-typeCYP71 ClanCYP71、CYP73、CYP75、CYP76、CYP77、CYP78、CYP79、CYP81、CYP82、CYP83、CYP84、CYP89、CYP92、CYP93、CYP98、CYP701、CYP703、CYP712、CYP736CYP51 ClanCYP51CYP72 ClanCYP72、CYP714、CYP715、CYP721、CYP734、CYP735non-A-typeCYP74 ClanCYP74CYP85 ClanCYP85、CYP87、CYP88、CYP90、CYP707、CYP716、CYP718

13、、CYP720、CYP722、CYP724、CYP728、CYP733、CYP 86 ClanCYP86、CYP94、CYP96、CYP704、CYP97 ClanCYP97CYP710 ClanCYP710CYP711 ClanCYP711CYP727 ClanCYP7271 Nebert DW, Adesnik M, Coon MJ, Estabrook RW, Gonzalez FJ, Guengerich FP, Gunsalus IC, Johnson EF, Kemper B, Levin W (1987) The P450 gene superfamily: recommende

14、d nomenclature. DNA 6(1):111 2 Nelson DR, Koymans L, Kamataki T, Stegeman JJ, Feyereisen R, Waxman DJ, Waterman MR, Gotoh O, Coon MJ, Estabrook RW, Gunsalus IC, Nebert DW. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics, 1996, 6,1423 Chap

15、ple C. Molecular-genetic analysis of plant cytochrome p450-dependent monooxygenasesJ. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998, 49:311. 4 Nelson DR, Werck-Reichhart D. A P450-centric view of plant evolution. Plant J, 2011, 66(1): 194211.1.1.4植物細胞色素P450參與的生物合成途徑植物細胞色素P450酶系具有廣泛的催化活性，在植物體內(nèi)催化多種次級代謝反

16、應(yīng)，主要參與萜類、苯丙烷類、生物堿，脂肪酸、植物激素和生菁糖苷類等的合成和代謝反應(yīng)；以及對殺草劑、殺蟲劑、環(huán)境毒素等毒害化學(xué)物質(zhì)等進行修飾，轉(zhuǎn)化為非毒性物質(zhì)，或為了抵抗外界的侵害而催化某些無毒性物質(zhì)成為毒性化合物1,2。1 CHAPPLE C.Molecular genetics analysis of plant cytochrome P450 dependent monooxygenases J.Annual Review of Plant Physiology and Mo2lecular Biology,1998,49: 311-343.2 Schuler MA, Werck-Reic

17、hhart D. Functional genomics of P450s. Annu Rev Plant Biol,2003,54: 629667.1.1.4.1萜類萜類是自然界中一大類天然化合物，包括類胡蘿卜素、赤霉素、脫落酸、甾體、醌類及植物防御物質(zhì)等。研究發(fā)現(xiàn)，P45O參與了許多萜類物質(zhì)的生物合成。單萜類化合物生物合成中，P450均可對檸烯、蒎烯、刺柏烯、樟腦、托品醇、松香二烯等進行羥基化修飾3。植物雙萜類衍生物赤霉素(GA)的生物合成途徑中由內(nèi)根-貝殼杉烯生成GA12-醛的過程中有連續(xù)5個步驟都由P450催化的4。紫杉醇生物合成的19個酶促反應(yīng)中有將近一半步驟由P450酶催化完成5。

18、3 Christopher JD, Croteau MR. Cytochrome P450 oxygenases of monoterpene metabolismJ. Phytochem Rev, 2006,5(2-3):373.4 Davidson SE, Reid JB, Helliwell CA. Cytochromes P450 in gibberellin biosynthesisJ. Phytochem Rev, 2006, 5(2-3):405.5 Kaspera R, Croteau R. Cytochrome P450 oxygenases of Taxol biosynt

19、hesisJ. Phytochem Rev, 2006, 5(2-3):433.1.1.4.2苯丙烷類在苯丙烷生物合成途徑中，已報道的P450參與的催化反應(yīng)超過16個，主要參與羥基化、脫烷基、環(huán)化以及芳基轉(zhuǎn)移等6。苯丙烷類合成途徑的最初的3個反應(yīng)步驟從苯丙氨酸到4-香豆輔酶A開始，經(jīng)PAL催化生成反式肉桂酸，然后由CYP450中的肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)催化生成對羥基肉桂酸(對香豆酸)。對香豆酸通過4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)轉(zhuǎn)變?yōu)?-香豆酰輔酶A，隨后進入木質(zhì)素、類黃酮及呋喃香豆素等下游代謝途徑。C4H是第一個被鑒定和克隆的植物細胞色素

20、P450單加氧酶7，迄今為止，已有許多植物的C4H基因被分離8,9。與其他CYP450相比，C4H在植株的各個組織器官中均具有很高活性。6 冷欣夫, 邱星輝。細胞色素P450酶系結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景，北京：科學(xué)出版社，2001，p:112.7 Fahrendorf T, Dixon RA. Molecular cloning of the elicitor-inducible cinnamic acid 4-hydroxylase cytochrome P450 from alfalfaJ. Arch Biochem Biophys, 1993, 305: 509- 515.8 Mizutan

21、i M, Ward E, DiMaio J, Ohta D, Ryals J, Sato R. Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450 (P450C4H) possessing cinnamate 4-hydroxylase activityJ. Biochem Biophys Res Commun. 1993, 190(3):875880. 9 Teutsch HG, Hasenfratz MP, Lesot A, Stoltz C, Garnier JM, Jeltsch J

22、M, Durst F, Werck-Reichhart D. Isolation and sequence of a cDNA encoding the Jerusalem artichoke cinnamate 4-hydroxylase, a major plant cytochrome P450 involved in the general phenylpropanoid pathway. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 May 1; 90(9): 41024106.1.1.4.3 芥子油苷和IAA的生物合成近年來，芥子油苷和生長素的生物合成途徑的探究是植物細

23、胞色素P450研究取得的顯著成果之一。芥子油苷是來源于氨基酸的植物天然產(chǎn)物，主要存在于十字花科植物中。當(dāng)植物組織受損傷時, 芥子油苷水解為某些腈和硫氰酸等一系列有毒物質(zhì)進行自身防御，同時，芥子油苷及其降解產(chǎn)物可用作抗癌藥物。芥子油苷的生物合成主要有細胞色素P450中的CYP79和CYP83兩個家族參與。其中CYP79家族催化氨基酸羥基化生成相應(yīng)的乙醛肟，而CYP83家族催化乙醛肟到芥子油苷的合成途徑10。生長素(吲哚-3-乙酸, IAA)作為促進植物生長的激素，影響植物根的發(fā)生、細胞的伸長和分裂、維管組織的分化以及植株向地性和向光性行為等。研究表明，植物可通過色氨酸依賴途徑(Trp-depen

24、dent pathway)和非色氨酸依賴途徑(Trp-independent pathway)等兩種方式進行IAA的生物合成。進一步研究表明，生長素的生物合成途徑與吲哚族芥子油苷的代謝存在交叉，在色氨酸依賴途徑中，色氨酸被CYP79B2和CYP79B3酶催化形成吲哚-3-乙醛肟（IAOx），而吲哚-3-乙醛肟是IAA和吲哚族芥子油苷生物合成的共同初始底物，可進一步形成生長素或吲哚族芥子油苷11。10 Bak S, Tax FE, Feldmann KA, Galbraith DW, Feyereisen R (2001) CYP83B1, a cytochrome P450 at the metabolic branch point in auxin and indole glucosinolate biosynthes