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文檔簡介

1、基因克隆基因克隆基因表達基因表達產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定一電轉(zhuǎn)移一電轉(zhuǎn)移 1將蛋白質(zhì)樣品進行將蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE，待溴酚藍跑出膠后停待溴酚藍跑出膠后停止電泳。止電泳。2戴手套切戴手套切24張定性濾紙和一張張定性濾紙和一張PVDF膜，它們的大膜，它們的大小應(yīng)與凝膠（去除濃縮膠）的大小相同。在膜的一小應(yīng)與凝膠（去除濃縮膠）的大小相同。在膜的一（左）角作一記號（或剪角），與濾紙和海綿（纖維）（左）角作一記號（或剪角），與濾紙和海綿（纖維）墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。3 先將先將PVDF膜浸泡在膜浸泡在100%甲醇中，再浸泡于轉(zhuǎn)移緩甲醇中，再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中沖液中

2、10分鐘；分鐘；4. 剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號。剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號。4. 次序：次序：負極（黑孔板）負極（黑孔板） 纖維墊纖維墊-12張濾紙張濾紙-凝膠凝膠-膜膜-1-2張濾紙張濾紙-纖維墊纖維墊-正極板（白孔板）正極板（白孔板） 扣上吊扣扣上吊扣 插進轉(zhuǎn)膜槽中。插進轉(zhuǎn)膜槽中。 + _ PVDF膜膜凝膠凝膠濾紙濾紙纖維墊纖維墊6. 將膜放入塑料盒中，加入將膜放入塑料盒中，加入20mL封閉液，置脫色搖床中封閉液，置脫色搖床中緩慢搖動，緩慢搖動，室溫室溫1小時小時或或4（層析冷柜）封閉過夜。（層析冷柜）封閉過夜。三靶蛋白與第一抗體結(jié)合三靶蛋白與第一抗體結(jié)合7棄去封閉液，用棄去封閉液，用Blocking solution稀釋一抗（稀釋一抗（1：400 = 40ml, 全班用），分全班用），分2份各份各20mL加入盒中，室溫平緩加入盒中，室溫平緩搖動溫育搖動溫育1小時。然后盡量回收抗體溶液，小時。然后盡量回收抗體溶液，- 20 保存，保存，可重復(fù)使用。可重復(fù)使用。 用用T TBST室溫洗膜室溫洗膜3次，每次次，每

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