微生物實(shí)驗(yàn) 2

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 王王 慧慧 利利實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 帶證件，物品在抽屜，實(shí)驗(yàn)室穿工作服 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)飲食、吸煙 離實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)將雙手刷洗干凈 值日生應(yīng)使實(shí)驗(yàn)室恢復(fù)原貌 將觀察后的培養(yǎng)物送消毒室處理 實(shí)驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)20%：平時(shí)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告10、技能考試10 實(shí)驗(yàn)報(bào)告：目的、原理、步驟、注意事項(xiàng)、結(jié)果及分析、思考題 實(shí)驗(yàn)報(bào)告：一般7.5-9.5，遲交7，訂兩本 實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)翔實(shí)、認(rèn)真 實(shí)驗(yàn)技能考試：四區(qū)劃線、革蘭染色、油鏡實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 無菌操作、細(xì)菌接種（斜面、液體、無菌操作、細(xì)菌接種（斜面、液體、半固體和平板）半固體和平板）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、

2、混雜微生物分離純化。 2、各種培養(yǎng)基上接種、移植和培養(yǎng) 3、無菌操作技術(shù)。 4、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長現(xiàn)象及菌落形態(tài)描述 5、細(xì)菌人工培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 1、無菌技術(shù)-在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其它微生物污染，同時(shí)也防止其污染環(huán)境的操作技術(shù)稱為無菌技術(shù)。 2、微生物需要一定的條件下生長（培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 接種工具準(zhǔn)備 無菌操作技術(shù) 斜面接種、液體接種、半固體穿刺接種和平板分區(qū)劃線接種 三、實(shí)驗(yàn)材料和用具三、實(shí)驗(yàn)材料和用具 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli）18-24h斜面培養(yǎng)物 1支 金黃色葡萄球菌（Staph

3、ylococcus aureus）18-24h斜面培養(yǎng)物 1支 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌18-24h肉湯培養(yǎng)物混合菌液 1支 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂平板平板培養(yǎng)基 2個(gè)/人 牛肉膏蛋白胨液體液體培養(yǎng)基（肉膏湯） 2支/人 牛肉膏蛋白胨固體斜面斜面培養(yǎng)基 2支/人 半固體半固體牛肉膏蛋白胨高層培養(yǎng)基 2支/人無菌技術(shù)無菌技術(shù) 無菌室：紫外燈3060min ， 空氣消毒 接種、倒平板：無菌室、超凈工作臺(tái)或酒精燈火焰 接種環(huán)針：用前后均需采用火焰滅菌 打開或關(guān)閉無菌試管和燒瓶：管口通過火焰23 次，開啟后盡量靠近火焰。不可使含菌材料污染臺(tái)面和其它物體 物品：應(yīng)嚴(yán)格消毒, 使用中不得與未經(jīng)滅菌的物

4、品接觸。 工作完畢：無菌室內(nèi)用紫外燈照射3Omin，人員消毒洗手。 因不慎造成污染時(shí) , 應(yīng)及時(shí)用消毒液處理 四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法 接種環(huán)的制作 接種環(huán)系采用一段長約4-5cm硬度適中的鎳合金絲。環(huán)要求閉合以蘸取液體滿環(huán)為準(zhǔn) 標(biāo)記：姓名（學(xué)號(hào)）、菌種 平板分區(qū)劃線：肉湯混合菌種 斜面接種法：針 、環(huán)各一支 肉湯管接種法 ：液、固各一支 半固體穿刺接種法 ：斜面、平板各一支 接種工具及滅菌 瓊脂平板四區(qū)劃線法 示教培養(yǎng) 接種后，37培養(yǎng)16-18h, 觀察并記錄 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組菌種上交實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 平板分區(qū)劃線：注意34區(qū)是否有兩種單個(gè)菌落，觀察并描述分離的單個(gè)菌落的特征 斜面：生長旺盛

5、的程度及表面有無菌苔生長 肉湯：表面-菌膜，液體中-混濁及色素，底部-沉淀 半固體：有動(dòng)力的穿刺線模糊或整個(gè)半固體混濁。 細(xì)細(xì)菌菌的的培培養(yǎng)養(yǎng)特特征征 色 素斜面培養(yǎng)基生長絲狀擴(kuò)散狀液 體 培 養(yǎng) 基 生 長 沉 淀 菌 膜、渾濁半 固 體 生 長 動(dòng)力觀察實(shí)驗(yàn)報(bào)告用實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （實(shí)驗(yàn)內(nèi)容題目）1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)原理3、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析5、注意事項(xiàng)6、思考題：將實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的簡單染色、顯微鏡使用 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?普通光學(xué)顯微鏡油鏡的使用和保養(yǎng)方法 微生物的涂片、簡單染色的操作 細(xì)菌菌落的形態(tài)觀察二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 菌落形態(tài)特征表述：大小、

6、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、表面、透明度、隆起、邊緣、氣味。 細(xì)菌菌體染色：菌體細(xì)胞小、無色半透明，在顯微鏡下菌體與背景反差小，不易觀察，通過染色，色素的沉著，反襯出菌體的形態(tài)。 光學(xué)顯微鏡的放大原理：物象的清晰度取決與放大倍數(shù)和顯微鏡的分辨率。分辨率是指顯微鏡能辨別物體最小間隔的能力。 分辨率（R）=0.61/NA; NA(數(shù)值口徑)=nsin/2; 為鏡口角，最大值為180，n為物鏡與 標(biāo)本之間介質(zhì)的折射率。香柏油n=1.51，載玻片的n=1.52，幾乎不發(fā)生折射。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌涂片 石炭酸復(fù)紅染液、呂氏美藍(lán)染液對涂片單染 無菌操作技術(shù)、接種環(huán)使用

7、油鏡觀察四、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)材料 1、涂片染色用菌種 金葡（Staphylococcus aureus ）斜面2支/組 大腸（Escherichia coli ） 斜面2支/組 液1支/組 枯草（Bacillus subtilis） 斜面2支/組 2、染色液 石炭酸復(fù)紅染液、呂氏美藍(lán)染液五、實(shí)驗(yàn)方法五、實(shí)驗(yàn)方法 涂片：涂片：載玻片-標(biāo)記-一小環(huán)生理鹽水（液體不加，菌液一環(huán)），-接種環(huán)取菌落少許-與生理鹽水混勻，涂布成直徑約10mm的均勻薄膜-將接種環(huán)燒灼滅菌 干燥：干燥：室溫自然干燥?；驑?biāo)本面向上，在遠(yuǎn)火高處略加溫。切勿緊靠火焰或時(shí)間過長，以免標(biāo)本烤枯而變形 固定：固定：殺死細(xì)菌，改變對染料的

8、通透性，凝固細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使菌體與玻片粘附得較牢，在染色時(shí)不致被染液和水沖掉。手托玻片一端，標(biāo)本面向上，在酒精燈焰上快速來回通過三次 染色：染色：在已固定片上滴染液，染1分鐘水洗：水洗：用細(xì)流水（自來水水流緩慢順著指甲或用洗液瓶）輕輕沖洗，并將玻片上殘留水份輕甩凈。干燥：干燥：吸水紙吸去載玻片上的水 鏡檢鏡檢：加一滴香柏油油鏡檢查，注意觀察菌體的形態(tài)和染色性 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 繪制在油鏡下觀察的微生物形態(tài) 注明物鏡的放大倍數(shù)和總放大倍數(shù) 六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng) 1、涂片要均勻，切忌太厚。2、圖片后的接種環(huán)要滅菌-無菌操作3固定時(shí)，不能離火焰太近，以免烤枯而變形4、不要讓染料沾

9、到地面、手指、實(shí)驗(yàn)服等上。5、注意油鏡的使用和保養(yǎng) ：顯微鏡的放置-調(diào)節(jié)光源-放置標(biāo)本-找合適的視野-加香柏油-調(diào)焦使用后的油鏡處理-鏡臺(tái)下降-取出標(biāo)本-清潔油鏡-清潔目鏡-清潔標(biāo)本-防治顯微鏡（）八字形，下降鏡臺(tái)）常用染色法 單染色法單染色法：用一種染料使細(xì)菌著色，如用美藍(lán)或稀釋石炭酸復(fù)紅等，只能觀察細(xì)菌的形態(tài)和大小，但不能鑒別細(xì)菌復(fù)染色法復(fù)染色法：用二種以上染料染色的方法，此法除顯示細(xì)菌形態(tài)大小外，還有鑒別細(xì)菌種類的價(jià)值。細(xì)菌學(xué)中最廣泛使用的復(fù)染色法是革蘭染色法還有抗酸染色法特殊結(jié)構(gòu)染色法特殊結(jié)構(gòu)染色法：細(xì)菌的某些結(jié)構(gòu)，如：鞭毛、莢膜、細(xì)胞壁、芽胞及異染顆粒等，用普通染色法不易著色，故需用

10、特殊染色法。這些染色法不僅能使特殊結(jié)構(gòu)著色，還可使特殊結(jié)構(gòu)染成與菌體不同的顏色，有利于觀察熒光染色法熒光染色法：細(xì)菌用熒光染料著色后在熒光顯微鏡下檢查，可在黑的背景中觀察到細(xì)菌發(fā)出明亮的熒光。此法有加快檢查速度和提高陽性率等優(yōu)點(diǎn)負(fù)染色法負(fù)染色法：是指背景著色而細(xì)菌本身不著色。常用有墨汁，也可用剛果紅或水溶性苯胺黑等，因酸性染料帶負(fù)電，故菌體不著色，只能使背景著色。實(shí)踐中可用墨汁負(fù)染色法檢查新型隱球菌的莢膜。背景呈黑色，莢膜不著色，包繞在菌體周圍成為一層透明的空圈。實(shí)驗(yàn)報(bào)告用實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （實(shí)驗(yàn)內(nèi)容題目）1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)原理3、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析5、注意事項(xiàng)6、思考題

11、：將實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書p23，p27實(shí)驗(yàn)三 革蘭氏染色法、動(dòng)力（懸滴、壓滴）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?革蘭染色的基本原理和方法 細(xì)菌不染色標(biāo)本在普通顯微鏡下的動(dòng)力觀察 細(xì)菌壓滴片和懸滴片的制作方法 二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 主要根據(jù)革蘭氏陰性細(xì)菌G-和 革蘭氏陽性菌G+由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的差異而引起的物理特性（脫色能力的不同)的不同，而表現(xiàn)出不同的染色效果。結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染涂片固定革蘭氏染色法（革蘭氏染色法（Gram Stain）由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立。結(jié)果: 陽性菌陽性菌紫色紫色 陰性菌陰性菌紅紅色色三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、金葡、枯草、

12、大腸桿菌涂片 2、涂片革蘭染色，鏡檢觀察，區(qū)別革蘭陰性菌和陽性菌 3、用無菌操作制壓滴片、懸滴片 ，高倍鏡、暗視野觀察 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 革蘭染色用的菌種金葡 （Staphylococcus aureus ） 1824小時(shí)平板平板大腸（Escherichia coli ） 1824小時(shí)平板平板枯草（Bacillus subtilis） 5日枯草平板平板糞鏈(Streptococcus faecalis) 1824小時(shí)液體液體革蘭染色液。 革蘭液（結(jié)晶紫染液） 革蘭液（95%酒精）革蘭液（盧戈碘液） 革蘭液（稀釋石炭酸復(fù)紅染液）制作壓滴片、懸滴片菌種普通變形（Psoteus Vulgar

13、is） 1824h液體液體銅綠假單胞（Pseudomonas aeruginosa） 1824h液體液體四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法 革蘭染色: 涂片干燥（自然干燥或借助火焰）固定（外焰2-3S/2-3次）結(jié)晶紫結(jié)晶紫初染（1min）細(xì)水流沖洗（瀝干細(xì)水流沖洗（瀝干水）水） 盧氏碘液盧氏碘液媒染（1min) 細(xì)水流沖洗（瀝干水）細(xì)水流沖洗（瀝干水）95%95%酒精酒精脫色（30s-1min）細(xì)水流沖洗（瀝干水）細(xì)水流沖洗（瀝干水） 石碳酸復(fù)紅石碳酸復(fù)紅復(fù)染（1min）水洗干燥鏡檢 染色時(shí)間：1，1、半，1標(biāo)記！ 1cm2 壓滴法: 將細(xì)菌懸液滴于載玻片中央，加上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。此法是研究

14、微生物形態(tài)最簡單、最基本的方法之一。懸滴法懸滴法: : 將細(xì)菌懸液于蓋玻片中央，翻轉(zhuǎn)，置于凹玻片的凹窩中央，由于細(xì)菌不受蓋玻片的壓力影響，所以，此法常用于觀察并區(qū)別細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的方式，也可觀察細(xì)菌的繁殖方式，及孢子萌發(fā)等?？衫冒狄曇帮@微鏡或相差顯微鏡形成黑暗背景、被檢物構(gòu)成亮點(diǎn)（小黑點(diǎn)）（小黑點(diǎn)）的特性進(jìn)行細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方式的觀察 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 藍(lán)紫色：革蘭陽性菌 紫紅色：革蘭陰性菌 有鞭毛的細(xì)菌為真正運(yùn)動(dòng)，無鞭毛的細(xì)菌則為分子運(yùn)動(dòng) （熱運(yùn)動(dòng)）與分子的布朗運(yùn)動(dòng)的區(qū)別。 六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng) 1、涂片要均勻，切忌太厚。2、圖片后的接種環(huán)要滅菌-無菌操作3固定時(shí)，不能離火焰太近，以免烤枯而

15、變形4、不要讓染料沾到地面、手指、實(shí)驗(yàn)服等上。5、酒精脫色是關(guān)鍵的一步；6、菌齡也會(huì)影響染色結(jié)果；7、壓片法注意產(chǎn)生氣泡、懸滴法避免液滴破散8、分辨細(xì)菌的真正運(yùn)動(dòng)與布朗運(yùn)動(dòng)9、嚴(yán)格的無菌操作。實(shí)驗(yàn)報(bào)告用實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （實(shí)驗(yàn)內(nèi)容題目）1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)原理3、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5、注意事項(xiàng)6、思考題：將實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書p30實(shí)驗(yàn)四 理化因素對細(xì)菌的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解抑制或殺死微生物的一些物理、化學(xué)因素的作用原理和方法 了解芽孢在消毒作用中的重要性。 了解紫外線對細(xì)菌的作用，了解某些染料和消毒劑的抑菌作用。 了解利用物理因素（熱力）對細(xì)菌的作用。 掌握幾種消毒劑的常

16、用工作濃度。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 微生物生長受環(huán)境條件的制約，不同的物理化學(xué)因子對微生物的作用機(jī)制不同（包括紫外線、熱力，化學(xué)消毒劑、結(jié)晶紫，過濾除菌)。 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、比較三種細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽胞桿菌，表皮葡萄球菌）對紫外線的抵抗力。 2、比較同一細(xì)菌在不同溫度（60、100、121）的抵抗力。 3、比較三種細(xì)菌在相同溫度的抵抗力。 4、比較不同化學(xué)消毒劑對同一細(xì)菌的作用（室溫）。 5、比較同一消毒劑對三種細(xì)菌的作用（室溫）。 6、比較不同濃度結(jié)晶紫染料對三種細(xì)菌的抑制作用。 7、驗(yàn)證濾菌器的除菌作用。四、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)材料 1、菌種：臨用前用無菌試管分裝 枯草芽

17、孢桿菌（Bacillus subtilis） 肉湯8支/組 大腸桿菌（Escherichia coli ）： 肉湯8支/組 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）肉湯8支/組 2、培養(yǎng)基：普通肉湯管21支， 普通瓊脂平板4塊，1:1000和1：5000結(jié)晶紫瓊脂平板各一塊 3、浸有各種藥品的小圓濾紙片： 3%過氧化氫、5%石炭酸、70%酒精、5%洗潔精、5%來蘇爾、0.1%新潔爾滅 五、實(shí)驗(yàn)方法五、實(shí)驗(yàn)方法 1、紫外線： 平板一塊，皿底標(biāo)記 無菌的棉簽無菌的棉簽- -肉湯菌種肉湯菌種- -浸潤浸潤- -在管壁稍擠在管壁稍擠- -平平板表面密集涂布板表面密集涂布-

18、-棉簽入消毒缸棉簽入消毒缸 再移至無菌室內(nèi)，打開皿蓋，將自行設(shè)計(jì)的各種形狀白紙放置于平板上，在距離紫外燈紫外燈30cm30cm處照射處照射20min20min，去紙?jiān)诰凭珶羯蠠?，滅火后將紙灰丟進(jìn)廢物缸。 蓋上平皿蓋，于 37溫箱中倒置培養(yǎng)培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。2、熱力不同熱力方式對細(xì)菌的作用a）分別取枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和表皮葡萄球菌菌液各各4 4管管，作好標(biāo)記，3管進(jìn)行如下處理：高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌121.3121.3，20min20min；沸水浴，；沸水浴，1min1min，5min5min，30min30min；6060，60min60min。另一管作為對照一管作為對照，不

19、做熱處理。b）處理完畢后，用棉簽蘸取菌液，涂布平板，涂布平板，作好標(biāo)記標(biāo)記。注意陰性、陽性對照。c）于 37溫箱中，培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。煮沸與作用時(shí)間的關(guān)系a）分別取枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和表皮葡萄球菌菌液各各3 3管管，作好標(biāo)記，放入沸水浴中。b）1min1min后，各取出后，各取出1 1管管，從每管中棉簽蘸取少許，分別接種平板接種平板，作好標(biāo)記。c）5min5min后，再各取出后，再各取出1 1管管，從每管中棉簽蘸取少許，分別接種平板接種平板，作好標(biāo)記。d）30min30min后后，將沸水浴中剩余的3支培養(yǎng)物取出，棉簽蘸取少許，涂布平板e(cuò)）于 37溫箱中，培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果

20、。3、化學(xué)消毒劑對細(xì)菌的作用 平板一塊，皿底標(biāo)記。將皿底劃成6等份，每份及圓心內(nèi)標(biāo)明一種藥物名稱。棉簽伸入肉湯菌種中浸潤，在管壁上稍擠。將浸菌的棉簽在平板表面密集涂布，將棉簽放入消毒缸中。無菌鑷子將浸有藥品的圓濾紙片（打孔器打好）取出，在管壁上瀝去多余藥液，無菌操作將紙片對號(hào)放入培養(yǎng)皿的各個(gè)小區(qū)內(nèi)。輕輕按壓輕輕按壓。將放好濾紙片的含菌培養(yǎng)皿倒置倒置于37溫箱中，培養(yǎng)1824小時(shí)。測定抑菌圈大小抑菌圈大小，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并說明其殺菌能力的強(qiáng)弱。紙片分布4、結(jié)晶紫的抑菌作用 將含結(jié)晶紫的瓊脂平板一分為三，作好標(biāo)記。 取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌各一接種環(huán)菌液分別涂布于平板表面相應(yīng)的位置上

21、 37培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。大腸桿菌枯草桿菌表皮葡萄球菌5、細(xì)菌的濾過除菌 用無菌注射器抽取1ml菌液，注入無菌濾器內(nèi)，加壓過濾加壓過濾，用1支無菌肉湯管接濾過的液體。做好標(biāo)記 取未過濾的培養(yǎng)物，接入肉湯管中 37培養(yǎng)1824小時(shí)，作為生長對照。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、描述紫外線處理所觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；2、列表調(diào)查結(jié)果六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng) 1、弄清楚各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的目的。2、分裝個(gè)種菌種，熱處理后再接菌，而不是接菌后處理。實(shí)驗(yàn)報(bào)告用實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （實(shí)驗(yàn)內(nèi)容題目）1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)原理3、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5、注意事項(xiàng)6、思考題：將實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書p55實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充內(nèi)容（一）紫外線殺菌機(jī)制

22、與特征1、紫外線誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體形成和DNA結(jié)構(gòu)的交聯(lián)，從而抑制復(fù)制2、紫外線輻射是空氣中的O2-O-+O2-O3-或者H2O+O2-H2O2特點(diǎn)：直線傳播，并被不同的表面反射 穿透力差，普通玻璃可吸收紫外線（二）消毒劑的殺菌和抑菌機(jī)制消毒劑：能迅速殺滅病原微生物的藥物稱防腐劑：能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物稱為機(jī)制：1、使細(xì)胞膜通透性改變 2、使菌體蛋白變性和凝固，失去生物活性。 3、破壞或改變蛋白和核酸功能基團(tuán)、使酶蛋白失活。 紫外線的作用（1）紫外線的作用（2） 消 毒 劑 的 作 用 效 果 觀 察實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的生理、生化反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?認(rèn)識(shí)染色方法鑒別細(xì)菌的局限性。

23、 學(xué)習(xí)了解常用幾個(gè)生理生化反應(yīng)原理、方法和結(jié)果判斷。 不同細(xì)菌IMViC實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 O-F實(shí)驗(yàn) KIA IMViC(4種) 硫化氫試驗(yàn) 尿素三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 1、菌種大腸桿菌（Escherichia coli ） 斜面 普通變形桿菌（Psoteus Vulgaris） 斜面 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 斜面 產(chǎn)氣桿菌 （Enterobacter aerogenes） 斜面 2、培養(yǎng)基O-F發(fā)酵管、KIA、蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、H2S試驗(yàn)用培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基3、試劑甲基紅試劑 1瓶/組V

24、-P試劑 液：5%萘酚 1瓶/組 液：40% KOH 1瓶/組 吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛） 1瓶/組無菌液體石蠟 1瓶/組四、實(shí)驗(yàn)原理四、實(shí)驗(yàn)原理 原理：各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，可利用的底物不同，代謝產(chǎn)物也不同，與一定的試劑發(fā)生生化反應(yīng)，顯示出的現(xiàn)象不同。所以被用來進(jìn)行細(xì)菌的分類與鑒定。生化反應(yīng)的原理 1、O-F試驗(yàn)-檢查細(xì)菌的代謝類型檢查細(xì)菌的代謝類型。氧化型：細(xì)菌分解葡萄糖，必須有氧，無氧不分解。專性需氧菌。發(fā)酵型：分解葡萄糖可無氧降解。有氧或無氧均可。兼性厭氧菌。不分解葡萄糖的細(xì)菌，稱為產(chǎn)堿型或不分解糖型。2、KIA-用于觀察細(xì)菌對葡萄糖、乳糖分解情況用于觀察細(xì)菌對葡萄糖、乳糖分解情

25、況。細(xì)菌分解葡萄糖、乳糖分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使斜面與底層均呈黃色斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。只分解葡萄糖而不分解乳糖只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但葡萄糖含量較少，所生成的少量酸可因接觸空氣而氧化，并因細(xì)菌生長繁殖利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面部斜面部分又變成紅色分又變成紅色，底層底層由于處于缺氧狀態(tài)，細(xì)菌分解葡萄糖所生成的酸類一時(shí)不被氧化而仍保持黃色保持黃色。細(xì)菌產(chǎn)生H2S時(shí)與培養(yǎng)基中硫酸亞鐵作用，形成黑色的硫化鐵黑色的硫化鐵。 3、硫化氫試驗(yàn)：檢查細(xì)菌能否分解含硫的氨基酸或化合檢查細(xì)菌能否分解含硫的氨基酸或化合物物 有機(jī)物，如胱氨

26、酸、半胱氨酸和甲硫氨酸產(chǎn)生硫化氫（H2S） H2S遇重金屬鹽類（如鉛鹽或鐵鹽等）則形成黑色黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物4、尿素-檢查細(xì)菌能否產(chǎn)生尿素酶，放檢查細(xì)菌能否產(chǎn)生尿素酶，放NH3,PHNH3,PH升高升高 尿素酶分解尿素釋放出氨 尿素瓊脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚紅酚紅。酚紅在pH6.8時(shí)為黃色黃色，而在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基的pH升高，在pH升至8.4時(shí)，指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯蠲倒寮t色深玫瑰紅色I(xiàn)MViC 吲哚試驗(yàn)（Indol test）：檢查細(xì)菌是否含有色氨酸酶檢查細(xì)菌是否含有色氨酸酶 細(xì)菌含色氨酸酶，分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，就

27、會(huì)形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物紅色化合物, ,否則陰性否則陰性。大腸桿菌此反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣桿菌陰性反應(yīng)。甲基紅試驗(yàn)（Methyred test）：檢驗(yàn)細(xì)菌的糖代謝。檢驗(yàn)細(xì)菌的糖代謝。 細(xì)菌將糖先分解為丙酮酸，丙酮酸再分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基變酸。甲基紅指示劑甲基紅指示劑pH4.2(pH4.2(紅色紅色) )6.36.3（黃色）（黃色），可使培養(yǎng)基由原來的橘黃色變?yōu)榧t色，即甲基紅試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則陰性。大腸桿菌陽性反應(yīng)，產(chǎn)氣桿菌陰性反應(yīng)。伏-普試驗(yàn)（vogesprokauer test）：檢驗(yàn)細(xì)菌的糖代謝檢驗(yàn)細(xì)菌的糖代謝 細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)行縮合，脫羧變成乙酰甲基甲醇，此

28、物在堿性條件下被空氣中的氧氣化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用生產(chǎn)紅色化合物，即伏普試驗(yàn)陽性反應(yīng)紅色化合物，即伏普試驗(yàn)陽性反應(yīng)，無紅色化合物產(chǎn)生為陰性。檸檬酸鹽試驗(yàn)（citrate test）：檢查細(xì)菌能否利用檸檬酸鹽為唯一碳源檢查細(xì)菌能否利用檸檬酸鹽為唯一碳源。 細(xì)菌在分解檸檬酸鈉鹽及培養(yǎng)基種的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH值升高，在有1 1溴麝香草酚藍(lán)溴麝香草酚藍(lán)指示劑的情況下，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)橛删G色變?yōu)樯钐m色，為陽性，否則為陰性深蘭色，為陽性，否則為陰性。指示劑的指示范圍為：pH值小于6.0時(shí)呈黃色，pH值為6.07.6時(shí)為綠色。五、實(shí)驗(yàn)方法五、實(shí)驗(yàn)方法 接種方法

29、：用接種針接種針，不用接種環(huán)。避免使培養(yǎng)基開裂造成假性產(chǎn)氣和影響動(dòng)力觀察生化管用試管裝，標(biāo)記在試管上生化管用試管裝，標(biāo)記在試管上每人做一株菌每人做一株菌 硫化氫試驗(yàn)取H2S試驗(yàn)用培養(yǎng)基（內(nèi)含有檸檬酸鐵銨），穿刺接種穿刺接種，在試管上注明菌名，置37恒溫培養(yǎng)1824h，培養(yǎng)后取出觀察，有黑色沉淀產(chǎn)生為陽性有黑色沉淀產(chǎn)生為陽性尿素分解取尿素培養(yǎng)基，用記號(hào)筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。穿刺接種穿刺接種。將接種后的試管置35中，培養(yǎng)2448h 紅色為陽性紅色為陽性將取有試驗(yàn)菌的接種針在KIA斜面自下而上劃一條線劃一條線，再直刺直刺入KIA的高層退回，然后在斜面上連續(xù)劃線斜面上連續(xù)劃線。 生長現(xiàn)象 結(jié)果判斷

30、記錄方法 高層黃色 利用葡萄糖產(chǎn)酸 斜面紅色 不利用乳糖 K/A； -/+高層黃色 利用葡萄糖產(chǎn)酸斜面黃色 利用乳糖產(chǎn)酸 A/A； +/+高層黃色并有氣泡 利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣斜面紅色 不利用乳糖 K/AG； -/高層黃色并有氣泡 利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣斜面黃色 利用乳糖產(chǎn)酸 A/AG； +/高層紅色不變 不利用葡萄糖斜面紅色 不利用乳糖 K/ K； -/-底部、高層或整管黑色 產(chǎn)硫化氫 H2S+；H2SKIA 試驗(yàn)O-F試驗(yàn) 接種 a)用接種針將菌穿刺接種到2 2支支O-F管中。 b）在其中1支管中加入無菌液體石蠟無菌液體石蠟，厚度達(dá)1cm1cm以上。 開口管 加石蠟管 結(jié)果 綠色黃色 綠色黃色

31、發(fā)酵型（F） 綠色黃色 綠色不變 氧化型（O）綠色藍(lán)色（或不變） 綠色不變 產(chǎn)堿型(不分解糖型)I-吲哚試驗(yàn)取蛋白胨水蛋白胨水培養(yǎng)基試管，穿刺接種穿刺接種。培養(yǎng)后加入吲哚試劑（對二甲氨基苯甲醛）2d2d ，液面出現(xiàn)紅色環(huán)紅色環(huán)為陽性為陽性。加入試劑后不可再搖動(dòng)不可再搖動(dòng)，否則被混合，紅色不明顯 M-甲基紅試驗(yàn)取葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖蛋白胨水（葡磷葡磷）培養(yǎng)基，分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌，置37恒溫培養(yǎng)1824h。培養(yǎng)后沿管壁加入甲基紅指示劑1d,1d,振動(dòng)混勻振動(dòng)混勻,上層呈現(xiàn)紅色為陽紅色為陽性性。Vi-伏普試驗(yàn)取葡萄糖蛋白胨水（葡磷）葡萄糖蛋白胨水（葡磷）培養(yǎng)基，

32、穿刺接種穿刺接種。培養(yǎng)后，加入5%萘酚溶液3 35d5d，然后加入1 12d2d的40%KOH，顛倒混勻顛倒混勻，37 1530min。呈紅色者，為伏紅色者，為伏- -普反應(yīng)陽性普反應(yīng)陽性。 C-檸檬酸鹽試驗(yàn)取檸檬酸鹽斜面，穿刺接種穿刺接種，置37恒溫培養(yǎng)48h后觀察，培養(yǎng)基顏色由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性綠色變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性，不變?yōu)殛幮?實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽性結(jié)果以“+”，陰性結(jié)果以“-”記錄，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果列表。 并以IMViC實(shí)驗(yàn)區(qū)分大腸桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌、銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 I M Vi C結(jié)果大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌K I A 結(jié) 果空白對照 大 腸 桿 菌 變 形 桿 菌 銅綠假

33、單胞菌O-F 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果發(fā) 酵 型 氧 化 型V-P 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 陰 性 陽 性陰性 空白 陽性甲 基 紅 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（唯一碳源）陽性 陰性陰性 陽性 空白尿 素 分 解 試 驗(yàn)陽性 陰性 吲 哚 試 驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六 培養(yǎng)基制備、高壓滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制原理及其常規(guī)配制程序 掌握培養(yǎng)基及器皿的滅菌方法 了解高壓蒸汽滅菌原理 學(xué)習(xí)并掌握高壓蒸汽滅菌的操作及注意事項(xiàng) 二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基培養(yǎng)基-是用人工的方法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按照微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定保存各種微生物或代謝產(chǎn)物。 分類：分類： 按營養(yǎng)物質(zhì)來成分:天然

34、培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基形態(tài)：液體、半固體（0.5%）、固體(12%) 按使用目的：選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基（血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液）、鑒別培養(yǎng)基等 常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的分別是：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基 瓊脂在95的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45才重新凝固。 高壓蒸汽滅菌法 一般用：0.1MPa（相當(dāng)于15 lbf/in2或1.05 kgf/cm2），121.3 121.3 ，1530min可達(dá)到徹底滅菌的目的 含糖培養(yǎng)基用0.06Mpa（8 lbf/in2 或 0.59 kgf/cm2）112.6112

35、.6滅菌 試管內(nèi)的培養(yǎng)基以0.1Mpa，121.3 ，20min即可 高壓滅菌技術(shù)關(guān)鍵是在壓力上升之前將鍋內(nèi)冷氣排盡冷氣排盡。若鍋內(nèi)未排盡冷空氣，結(jié)果會(huì)造成滅菌不徹底。 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 每小組配400ml：液體培養(yǎng)基100ml、半國體50ml、斜面50ml、剩余作為250ml左右制成固體培養(yǎng)基，準(zhǔn)備傾注1015個(gè)平皿 高壓滅菌，無菌操作傾注平皿 四、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)材料 1、器械設(shè)備：藥物天平及砝碼，高壓蒸汽滅菌器，隔水式培養(yǎng)箱，電爐 2、玻璃器皿：（每組） 三角燒瓶（250ml）1只 無菌平皿（直徑9cm）15只 試管 12100mm 40支（液體） 15100mm 20支（斜面1

36、0 半固體10） 燒杯（500ml）1只 刻度吸管10ml 2支 燒杯（100ml）2只 刻度吸管1ml 2支 量筒500ml1只 玻璃棒1支四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方 組分含量（每1000ml） 牛肉浸膏5g 蛋白胨10g 氯化鈉5g 瓊脂:半固體0.5%、固體培養(yǎng)基2% 自來水1000ml pH7.4-7.6 滅菌條件: 1.05kg/cm2 20min步 驟 計(jì)算和稱量 -溶解-調(diào)節(jié)pH -過濾 -分裝加塞 -包扎 -注明培養(yǎng)基名稱、組名、日期-滅菌-擱置斜面或傾注平板-無菌觀察 高壓滅菌后培養(yǎng)基pH下降0.20.3 高壓步驟 ：加水-放入待滅菌物品-加蓋-加熱、排

37、放冷空氣及升溫滅菌-滅菌完畢降溫及后處理 無菌試驗(yàn) 可抽取部分滅菌的培養(yǎng)基置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h。若無菌生長，即視為滅菌徹底。斜面的擺法和冷凝 倒平板 冷至556O時(shí)，在無菌室內(nèi)以無菌操作傾入無菌的空平皿內(nèi)，冷凝 9Omm 直徑的平皿約需2Oml培養(yǎng)基。待凝固后翻轉(zhuǎn)平皿 注意事項(xiàng) 1、藥品的稱量規(guī)則 2、調(diào)節(jié)pH值在加入瓊脂之前 3、制備好的培養(yǎng)基應(yīng)立即滅菌。 4、正確使用高壓蒸汽滅菌器。 高壓蒸汽滅菌法 滅菌時(shí)人不能離開現(xiàn)場，控制滅菌的壓力和溫度，防治事故發(fā)生 根據(jù)不同的培養(yǎng)基可適當(dāng)調(diào)整壓力和溫度，保護(hù)營養(yǎng)不被破壞。 滅菌結(jié)束，一定要待壓力為零時(shí)才能打開鍋蓋。 高壓滅菌技術(shù)關(guān)鍵是在

38、壓力上升之前將鍋內(nèi)冷氣排盡冷氣排盡。若鍋內(nèi)未排盡冷空氣，結(jié)果會(huì)造成滅菌不徹底。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 每組完成： 40支液體、10斜面、10支半固體高層，傾注平板15-20只 將配制完成的培養(yǎng)基作好標(biāo)記置冰箱保存 多余培養(yǎng)基在老師指導(dǎo)下回收在規(guī)定容器中。 實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 藥敏實(shí)驗(yàn)（紙片法）和乳酸菌的染色藥敏實(shí)驗(yàn)（紙片法）和乳酸菌的染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握Kirby-Bauer法的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù) 掌握K-B法的注意事項(xiàng)和質(zhì)量控制二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 干燥干燥的浸有一定濃度一定濃度抗菌藥物的濾紙片放在已接種一定量一定量某種細(xì)菌的瓊脂平板上。 藥物藥物在瓊脂中的濃度隨離開紙片的距離增大

39、而降低。 當(dāng)瓊脂內(nèi)的藥物濃度恰高于該藥對待檢細(xì)菌的最低抑菌濃度，經(jīng)培養(yǎng)后，可在紙片周圍出現(xiàn)無細(xì)菌生長區(qū)，稱抑菌環(huán)抑菌環(huán)。 測量抑菌環(huán)的大小抑菌環(huán)的大小，即可判定該細(xì)菌對某種藥物的敏感程度。 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測備檢培養(yǎng)基、藥敏紙片的質(zhì)量 KB法檢測臨床分離菌株的藥敏結(jié)果四、藥敏試驗(yàn)步驟四、藥敏試驗(yàn)步驟 菌種：平板上菌種：平板上1 1、2 2、3 3號(hào)菌號(hào)菌 1 1、5ml5ml細(xì)菌懸液的制備細(xì)菌懸液的制備-接種環(huán)沾取細(xì)菌接種環(huán)沾取細(xì)菌( (約約3-43-4個(gè)菌個(gè)菌落落) )加入到加入到5ml5ml無菌生理鹽水中，比濁達(dá)無菌生理鹽水中，比濁達(dá)0.50.5麥?zhǔn)蠁挝畸準(zhǔn)蠁挝?然后密

40、集涂于平板培養(yǎng)基上，以便生長出均勻的菌苔然后密集涂于平板培養(yǎng)基上，以便生長出均勻的菌苔( (注注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基) ) 2 2、另一方面革蘭氏染色，判斷、另一方面革蘭氏染色，判斷G-G-或或G+G+ 3 3、做好標(biāo)記、做好標(biāo)記, ,酒精點(diǎn)燃滅菌的小鑷子取藥物紙片貼于平酒精點(diǎn)燃滅菌的小鑷子取藥物紙片貼于平板培養(yǎng)基上（注意距離），并輕輕按壓貼緊板培養(yǎng)基上（注意距離），并輕輕按壓貼緊 G- G- 菌菌: :氟哌酸（諾氟沙星）、丁胺卡那（阿米卡星）、氟哌酸（諾氟沙星）、丁胺卡那（阿米卡星）、紅霉素、復(fù)方磺胺（新諾明）、四環(huán)素、氯霉素、先鋒紅霉素、復(fù)方磺胺（新諾明）、四環(huán)素、氯霉素、先鋒

41、V V； G+ G+ 菌菌: :氨芐青霉素或青霉素氨芐青霉素或青霉素G G、紅霉素、復(fù)方磺胺、四環(huán)、紅霉素、復(fù)方磺胺、四環(huán)素（多粘菌素）、氯霉素、先鋒素（多粘菌素）、氯霉素、先鋒V V等。等。 每人使用每人使用1 1個(gè)個(gè)M-HM-H培養(yǎng)基做藥敏實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基做藥敏實(shí)驗(yàn) 3 3、放、放3737溫箱培養(yǎng)過夜溫箱培養(yǎng)過夜( (不超過不超過17h)17h)，調(diào)查結(jié)果。，調(diào)查結(jié)果。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察紙片周圍有無抑菌環(huán)，并測其直徑大小。 最終判斷細(xì)菌對每種抗菌藥物的敏感程度，記錄和報(bào)告結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)條件不同判定標(biāo)準(zhǔn)可有所不同。參照抑菌環(huán)直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn)（見附表10-2和10-3）。紙片

42、分布抗生素對細(xì)菌的作用實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 ss培養(yǎng)基配制、真菌、放線菌培養(yǎng)，一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)真菌的接種方法和放線菌的分離 學(xué)習(xí)觀察酵母菌、曲霉、根霉、青霉、細(xì)黃鏈霉菌的菌落形態(tài)特征。 掌握酵母菌、放線菌、霉菌主要的培養(yǎng)特性 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 放線菌和霉菌的細(xì)胞都是絲狀，固體培養(yǎng)基:營養(yǎng)菌絲營養(yǎng)菌絲(或基內(nèi)菌絲)、氣生菌絲、孢子絲氣生菌絲、孢子絲 氣生菌絲向空間生長，菌絲之間無毛細(xì)管水，因此菌落外觀呈干燥、不透明的絲狀、絨毛狀或皮革狀等特征。由于營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基中使菌落和培養(yǎng)基連接緊密，故菌絲不易被挑起不易被挑起 由于氣生菌絲、孢子和營養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面正反面呈不同的顏色。 絲

43、狀菌是以菌絲頂端延長菌絲頂端延長的方式進(jìn)行生長的，越近菌落中心的氣生菌絲其生理年齡越大，也越早分化出子實(shí)器官或分生孢子，從而反映在菌落顏色上的變化，一般情況下，菌落中心的顏色常比邊緣深。有些菌的營養(yǎng)菌絲還會(huì)分泌水溶性色素并擴(kuò)散到培養(yǎng)基中而使培養(yǎng)基變色。有些菌的氣生菌絲在生長后期還會(huì)分泌液滴，因此，在菌落上出現(xiàn)“水珠”。 霉菌屬真核生物，它們的菌絲一般較放線菌粗(幾倍)且長(幾倍至幾十倍)，其生長速度比放線菌快，故菌落大而疏松或大而緊密。由于氣生菌絲會(huì)形成一定形狀、構(gòu)造和色澤的子實(shí)器官，所以菌落表面往往有肉眼可見的構(gòu)造和顏色。因此，用低倍顯微鏡即可觀察。 孟加拉紅孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基是一種用來

44、分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的特點(diǎn)是培養(yǎng)基中加入的孟加拉紅，能有效地抑制細(xì)菌和放線菌的生長，而對真菌無抑制作用，因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以得到優(yōu)勢生長，從而達(dá)到分離真菌的目的。 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是一種廣泛用于霉菌的培養(yǎng)基，在配制過程中，不經(jīng)pH調(diào)節(jié)而呈自然狀態(tài)。PDA培養(yǎng)基是一種普遍用于酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，被推薦用于各類食品和飲料中酵母菌和霉菌檢測和計(jì)數(shù)。 高氏一號(hào)高氏一號(hào)培養(yǎng)基是一種用于放線菌的合成培養(yǎng)基，以可溶性淀粉作為碳源和能源，硝酸鉀作為氮源，磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵作為無機(jī)鹽。放線菌的培養(yǎng)往往在平板中加入0.5%重鉻酸鉀溶液（或50U/ml制霉菌

45、素) 以抑制霉菌的生長。 沙保弱沙保弱培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)鑒定酵母樣真菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)培養(yǎng)基，最常用于臨床上念珠菌的分離培養(yǎng)。 SS培養(yǎng)基 SS培養(yǎng)基是一種分離培養(yǎng)糞便標(biāo)本中沙門菌和痢疾桿菌的強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基之一。 培養(yǎng)基組成 營養(yǎng)物：牛肉膏、蛋白胨； 抑制劑：煌綠、膽鹽、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉等-抑制非病原菌的生長。 鑒別用糖：乳糖 指示劑：中性紅淀粉瓊脂培養(yǎng)基配方淀粉瓊脂培養(yǎng)基配方( (高氏一號(hào)高氏一號(hào)) ) 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基成分（馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基成分（PDAPDA） 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 SS培養(yǎng)基配制-250ml/組。 練習(xí)平板稀釋劃線法分離單菌落 白色假絲酵母菌、曲霉、根霉的小室培養(yǎng)

46、 觀察酵母菌、白假絲酵母菌、細(xì)黃鏈霉菌曲霉、根霉、青霉在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征。 實(shí)驗(yàn)步驟1 1、SSSS培養(yǎng)基的配置方法培養(yǎng)基的配置方法-配置配置250ml/250ml/組組（參照說明）（參照說明） 計(jì)算和稱量 -溶解-調(diào)節(jié)pH -過濾 -分裝加塞 -包扎 -注明培養(yǎng)基名稱、組名、日期-傾注平板-無菌觀察 不需高壓滅菌高壓！2 2、練習(xí)平板稀釋分區(qū)劃線法獲得單菌落、練習(xí)平板稀釋分區(qū)劃線法獲得單菌落 2塊/人四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法制備菌懸液或孢子懸液：孢子懸液：在培養(yǎng)好的斜面菌種管內(nèi)加入5mL無菌水，振蕩混勻,制成菌懸液后備用（已制備）。1、分離放線菌： A土壤津液10-2 取0.5ml于4

47、.5ml的生理鹽水中混勻（ 10-3 ）再取10-3 0.5ml于4.5ml的生理鹽水中混勻獲得10-4 分別取1ml 10-3 、 10-4加入到20ml的高十一號(hào)培養(yǎng)（60Co）+10%苯酚抑制細(xì)菌和真菌的生長混合倒平板，凝固后28Co培養(yǎng)霉菌培養(yǎng)箱1周四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法2、酵母菌-分區(qū)稀釋劃線法接-菌種為試管斜面 所用培養(yǎng)基為沙寶弱培養(yǎng)基，1塊平板/人3、霉菌（絲狀真菌）接種：B、C、D（分別為根霉、曲霉和青霉） 用三點(diǎn)接種法三點(diǎn)接種法獲得霉菌的菌落。 使用 沙寶弱、虎紅培養(yǎng)基分別接三種真菌各1塊/組（每組3塊虎紅、3塊沙寶弱） 分離與接種的酵母菌、真菌于2828培養(yǎng)2-3d，霉菌

48、置2828培養(yǎng)5-7d，待長成菌落后，仔細(xì)觀察，并記錄觀察結(jié)果。小室培養(yǎng) 準(zhǔn)備濕室準(zhǔn)備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12l濕熱滅菌30min后，置60烘箱中烘干，備用。接種接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。加培養(yǎng)基加培養(yǎng)基 用無菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量一般以l/2小滴為宜)。加蓋玻片加蓋玻片 在

49、培養(yǎng)基未徹底凝固前用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁，否則不透氣。倒保濕劑倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置2828恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)3-5d3-5d。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 真菌的菌落從形態(tài)觀察可分三大類：酵母菌落、酵母樣（型）菌落及絲狀菌落。1、酵母菌落（觀察釀酒酵母菌培養(yǎng)物）：菌落為圓形、較白色，邊緣整齊表面光滑、濕潤，假菌絲不伸入到培養(yǎng)基內(nèi)，和表皮葡萄球菌菌落相似。 2、酵母樣（型）菌落（觀察白假絲酵母菌）：表面和酵母

50、菌落相似，但生成的假菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)。 3、絲狀菌落：觀察各種絲狀菌（Dermatophytes）斜面培養(yǎng)物,菌落表面大都有氣生菌絲（Aerial mycelium）,肉眼觀察呈絨毛狀、粉狀、棉花樣等，故稱絲狀菌落，色澤多種多樣，紅色毛菌呈紫紅色，鐵銹色毛菌呈鐵銹色或棕色等，菌落底層有營養(yǎng)菌絲（Vegetative mycelium）伸入培養(yǎng)基內(nèi)。注意放線菌與霉菌的區(qū)別。4、白假絲酵母菌 接種到玉米-吐溫瓊脂小室培養(yǎng)4872觀察厚膜孢子。白假絲酵母菌接種到血清管68h觀察芽管形成情況，繼續(xù)培養(yǎng)1824h，觀察假菌絲。5、濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片 從培養(yǎng)1620h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌

51、發(fā)、菌絲體的生長分化和子實(shí)體的形成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔，曲霉和黑霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉的假根，青霉可形成頂囊的分生孢子梗和帚狀枝等。菌落形態(tài) 濕潤（群體形態(tài)） 干燥小而薄，較大而薄-細(xì)菌又大又厚，顏色單一-酵母菌小而致密-放線菌大而疏松-霉菌個(gè)體形態(tài)分散的細(xì)胞細(xì)絲體小而分散-細(xì)菌大而分散-酵母菌纖細(xì)-放線菌粗壯-霉菌放線菌與霉菌菌落特征放線菌與霉菌菌落特征 放線菌和霉菌的細(xì)胞都是絲狀，固體培養(yǎng)基:營養(yǎng)菌絲營養(yǎng)菌絲(或基內(nèi)菌絲)、氣生菌絲、孢子絲氣生菌絲、孢子絲 氣生菌絲向空間生長，菌絲之間無毛細(xì)管

52、水，因此菌落外觀呈干燥、不透明的絲狀、絨毛狀或皮革狀等特征。由于營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基中使菌落和培養(yǎng)基連接緊密，故菌絲不易被挑起不易被挑起 由于氣生菌絲、孢子和營養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面正反面呈不同的顏色。酵母菌的菌落酵母菌的菌落酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)酵母菌細(xì)胞形態(tài)子囊孢子有性繁殖酵母菌的細(xì)胞 結(jié)構(gòu)與其他真核生物基本相同，右圖是電子顯微鏡下的釀酒酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖。液泡1)單層膜包裹的細(xì)胞 器；含有機(jī)酸、鹽 類 水溶液和水解 酶類。 2)調(diào)節(jié)滲透壓； 與細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行物質(zhì) 交換； 儲(chǔ)藏物質(zhì)。 3)為細(xì)胞成熟的標(biāo)志 菌落特征：菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，霉菌的菌落大、疏松

53、、干燥、不透明，多呈絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀等，菌體可沿培養(yǎng)基表面多呈絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀等，菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，蔓延生長，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、所以菌落可呈紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、灰等多種顏色?；业榷喾N顏色。霉菌的培養(yǎng)特征霉菌的培養(yǎng)特征各種曲霉的菌落 東京根霉 酵 母菌 落 形 態(tài)黑曲霉毛霉菌霉菌孢子污染平板高鹽察氏斜面 孟加拉紅斜面三點(diǎn)接種（正面）三點(diǎn)接種（背面）曲霉菌生長（正面）曲霉菌生長（背面）鏡下觀察真菌結(jié)構(gòu)根霉（根霉（Rhizopus)Rhizopus)分類地位：與毛霉同屬接合菌綱毛分

54、類地位：與毛霉同屬接合菌綱毛霉目霉目形態(tài)特征：菌絲為白色、形態(tài)特征：菌絲為白色、無隔無隔多核多核的單細(xì)胞真菌，多呈的單細(xì)胞真菌，多呈絮狀絮狀。繁殖方式：無性產(chǎn)繁殖方式：無性產(chǎn)孢囊孢子孢囊孢子，有性，有性產(chǎn)產(chǎn)接合孢子接合孢子代表種：米根霉（代表種：米根霉（R.oryzae)R.oryzae) 應(yīng)用應(yīng)用: :產(chǎn)酶、產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、甾體產(chǎn)酸、甾體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Rhizopus 與毛霉區(qū)別：根霉有假與毛霉區(qū)別：根霉有假根和匍匐枝，與假根相根和匍匐枝，與假根相對處向上生出孢囊梗。對處向上生出孢囊梗。孢子囊梗與囊軸相連處孢子囊梗與囊軸相連處有囊托，無囊領(lǐng)。有囊托，無囊領(lǐng)。曲霉曲霉(Aspergillus)分類地位：

55、多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于分類地位：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門半知菌亞門形態(tài)特征：菌絲發(fā)達(dá)多分枝，有隔多核，分形態(tài)特征：菌絲發(fā)達(dá)多分枝，有隔多核，分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細(xì)生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細(xì)胞胞足細(xì)胞足細(xì)胞上垂直生出；分生孢子頭狀如上垂直生出；分生孢子頭狀如“菊花菊花”繁殖方式繁殖方式 ：分生孢子分生孢子，有性，有性- - 子囊孢子子囊孢子代表種：黑曲霉代表種：黑曲霉( (Asp . NigerAsp . Niger）、）、黃曲霉黃曲霉( (Asp.flavus)Asp.flavus)應(yīng)用：制醬、釀酒、制醋，應(yīng)用：制醬、釀酒、制醋，生產(chǎn)酶，生產(chǎn)有機(jī)酸

56、，生產(chǎn)生產(chǎn)酶，生產(chǎn)有機(jī)酸，生產(chǎn)糖化飼料糖化飼料危害：黃曲霉毒素危害：黃曲霉毒素（aflatoxin)aflatoxin)是一種肝毒素是一種肝毒素Aspergillus黑曲霉的分生孢子頭黑曲霉的分生孢子頭（四）青霉（四）青霉（Penicillum):分類地位：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于分類地位：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門半知菌亞門形態(tài)特征：與曲霉類似。但無足細(xì)胞，分生形態(tài)特征：與曲霉類似。但無足細(xì)胞，分生孢子梗從基絲或氣絲上生出，有橫隔，頂端孢子梗從基絲或氣絲上生出，有橫隔，頂端生有掃帚狀的分生孢子頭生有掃帚狀的分生孢子頭繁殖方式：分生孢子、有性繁殖方式：分生孢子、有性- -子囊孢

57、子子囊孢子代表種代表種 ：產(chǎn)黃青霉、桔青霉、展青霉：產(chǎn)黃青霉、桔青霉、展青霉應(yīng)用：生產(chǎn)抗生應(yīng)用：生產(chǎn)抗生素、生產(chǎn)有機(jī)酸素、生產(chǎn)有機(jī)酸危害：霉變、疾危害：霉變、疾病病根霉假根黑曲霉足細(xì)胞和菌絲 根霉匍匐枝 曲霉孢子囊及孢子根霉孢子囊曲霉菌絲及孢子囊酵母細(xì)胞和芽殖厚 膜 孢 子厚 膜 孢 子放線菌的菌落形態(tài)放線菌的菌落形態(tài)質(zhì)地質(zhì)地: 致密、干燥、多皺、小致密、干燥、多皺、小而不蔓延、不挑起，表面有而不蔓延、不挑起，表面有放射狀溝紋。放射狀溝紋。 形狀：隨菌種不同可有兩類：形狀：隨菌種不同可有兩類： (1)產(chǎn)生大量分枝狀菌絲的菌產(chǎn)生大量分枝狀菌絲的菌種：種： 如如Strptomyces)形成與培形成

58、與培養(yǎng)基結(jié)合較緊的養(yǎng)基結(jié)合較緊的 菌落，不易菌落，不易挑起或整個(gè)挑起。挑起或整個(gè)挑起。 (2)不產(chǎn)生大量菌絲的菌種：不產(chǎn)生大量菌絲的菌種： 如如Nocardia形成的菌落呈粉形成的菌落呈粉質(zhì)，挑之易碎質(zhì)，挑之易碎放線菌孢子絲類型：二級(jí)輪生一級(jí)輪生叢生松螺旋緊螺旋鉤狀單輪生單輪生螺旋狀螺旋狀放線菌孢子絲的顯微圖片放線菌孢子絲的顯微圖片: :Coiled aerial hyphae橫隔分裂縮縊分裂分生孢子孢子囊孢子無性孢子（主要）無性孢子（主要）菌絲片段菌絲片段放線菌的繁殖放線菌的繁殖放線菌的繁殖方式放線菌的繁殖方式孢子形態(tài)及其特點(diǎn)孢子形態(tài)及其特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 腸道致病菌的分離（一）ss培養(yǎng)基配制

59、 SS瓊脂作為糞便標(biāo)本分離培養(yǎng)沙門菌與痢疾桿菌用的強(qiáng)選擇強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基之一，成分較多，大體可分為營養(yǎng)物質(zhì)、抑制物質(zhì)及促進(jìn)目的菌生長物質(zhì)及鑒別用指示劑。 培養(yǎng)基組成 營養(yǎng)物：牛肉膏、蛋白胨 抑制劑：煌綠、膽鹽、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉等能抑制非病原菌的生長。 促進(jìn)目的菌生長的物質(zhì)：膽鹽既為抑制劑又能促進(jìn)病原菌，特別是沙門菌的生長。 鑒別用糖：乳糖。 指示劑：中性紅 配置:計(jì)算-稱量-加水-煮沸-倒平板SS培養(yǎng)基組成成分 分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察 直接分離分離培養(yǎng)。將模擬標(biāo)本（大腸埃希菌和沙門菌的混合菌液）分區(qū)劃線法接種于s.s瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824h，觀察培養(yǎng)基上兩種菌落的

60、特征。 選擇性增菌選擇性增菌培養(yǎng)。無菌吸管吸取混合菌液或經(jīng)處理的病料上清液按1：10的比例加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）中，置37培養(yǎng)68h。按步驟（1）進(jìn)行分離培養(yǎng)。 形態(tài)觀察。分別挑取上述平板中單獨(dú)菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察兩種細(xì)菌的形態(tài)、大小與排列方式，進(jìn)行比較。大腸埃希菌在伊紅美藍(lán)平板上產(chǎn)生帶金屬光澤的菌落，在S.S平板上形成紅色的菌落紅色的菌落；沙門菌大多數(shù)菌株因沙門菌大多數(shù)菌株因不發(fā)酵乳糖不發(fā)酵乳糖伊紅美藍(lán)平板上形成無色菌落，在S.S平板上圓形、光滑、濕潤、凸起、半透明的、直徑在13mm的無色的菌落。 從形態(tài)和染色特征上大腸埃希菌和沙門菌均為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，兩