第十八章 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用ppt課件

1、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)：antigen-antibody reaction。是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)：serological reaction。指體外的抗原-抗體反應(yīng)。特異性：親和力、親合力、交叉反應(yīng)可逆性可見性階段性電解質(zhì)酸堿度溫度中和反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)酶免疫測(cè)定法免疫熒光法 放射免疫測(cè)定法1. 直接凝集反應(yīng)：直接凝集反應(yīng)： 顆粒性抗原顆粒性抗原+相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體凝集凝集 玻片法：細(xì)菌及玻片法：細(xì)菌及ABO血型鑒定血型鑒定 試管法：肥達(dá)氏反應(yīng)試管法：肥達(dá)氏反應(yīng) 抗原吸附于載體+相應(yīng)抗體凝集

2、 常用載體：乳膠顆粒、羊紅細(xì)胞將可溶性抗原與相應(yīng)抗體預(yù)先作用，再加入相應(yīng)的致敏顆粒。用處：檢測(cè)單價(jià)抗體直接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)結(jié)合在Rh+紅細(xì)胞上的單價(jià)抗體；間接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)游離的Rh單價(jià)抗體。 可溶性抗原可溶性抗原+相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體沉淀沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：測(cè)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：測(cè)Ig、補(bǔ)體含量。、補(bǔ)體含量。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：火箭電泳：火箭電泳：Ag 置置“”極極對(duì)流免疫電泳：對(duì)流免疫電泳：Ag置置“”極，極，Ab置置“”極極免疫電泳：免疫電泳：免疫比濁法：免疫比濁法：環(huán)狀沉淀絮狀沉淀原理：將雙擴(kuò)與電泳技術(shù)結(jié)合在一起，測(cè)定可溶 性抗原。 陰極 陽極 （-） （+）

3、 電泳 電滲 AgAb將單向免疫擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測(cè)定標(biāo)本中可溶性抗原的含量。先電泳分離標(biāo)本中抗原成分，再沿電泳方向挖抗體槽，加抗體，進(jìn)行雙擴(kuò)。用于血清蛋白及抗體成分的分析及抗原/抗體提取物純化鑒定。該技術(shù)是利用抗原抗體復(fù)合物在液相中形成濁度來測(cè)量抗原含量的方法。方法：透射光比濁法散射光比濁法免疫乳膠比濁法速率抑制免疫比濁法此類反應(yīng)是利用抗體與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合后，使反應(yīng)體系中補(bǔ)體激活導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的。補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)： 待測(cè)抗原待測(cè)抗體待測(cè)的反應(yīng)系統(tǒng)） 補(bǔ)體 抗體紅細(xì)胞指示系統(tǒng)）溶血空斑試驗(yàn)HLA血清學(xué)分型法：即補(bǔ)體依賴的微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定

4、位、定量、定性測(cè)定。標(biāo)記物：熒光素、酶、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、膠體金等。類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)等。是用酶標(biāo)記Ab進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。常用的酶：辣根過氧化酶、堿性磷酸酶常用底物：鄰苯二胺OPD）常用方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 免疫組化法夾心法測(cè)抗原） 間接法測(cè)抗體）用于效應(yīng)細(xì)胞分泌單一細(xì)胞因子的測(cè)定。生物素-親和素系統(tǒng)BAS是一生物放大系統(tǒng)，利用親和素-生物素-酶的連接關(guān)系，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原，靈敏度高。Immunohistochemisty Technique是用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合發(fā)

5、生反應(yīng)，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)的技術(shù)。直接法直接法 ：用已知熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)未知抗原。：用已知熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)未知抗原。間接法：間接法： 用熒光標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)未知的抗原用熒光標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)未知的抗原/抗體。抗體。補(bǔ)體法：補(bǔ)體法：將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來的技術(shù)，測(cè)定激素和藥物。常用I125和I131快速，敏感pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性。Immunological colloidal gold signature是用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用以檢測(cè)未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析。免疫層析法：immunoch

6、romatography首先將已知特異性抗體固定于硝酸纖維素膜上某一區(qū)帶；測(cè)試時(shí)將上述硝酸纖維素膜一端浸入待檢樣品中尿液或血清），通過毛細(xì)管作用樣品將沿膜向前移動(dòng)；當(dāng)樣品進(jìn)入特異性抗體固定區(qū)帶時(shí)，若樣品中含有相應(yīng)抗原即可與該區(qū)帶抗體特異性結(jié)合，進(jìn)而通過免疫膠體金所呈現(xiàn)的紫紅色條帶判定試驗(yàn)結(jié)果。首先將膠體金致敏抗體膠體金標(biāo)記的鼠抗人絨毛膜促性腺激素HCG特異性抗體，松弛附著在玻璃纖維上，再將上述玻璃纖維固定在硝酸纖維素膜G處；將鼠抗人HCG特異性抗體固定在硝酸纖維素膜T處；將兔抗鼠IgG抗體二抗固定在硝酸纖維素膜C處；硝酸纖維素膜最下方A處附吸水紙是滴加待檢或接觸尿液部位，在硝酸纖維素膜最上方B

7、處有吸水紙，有助于形成毛細(xì)管層析作用。 將待檢尿液滴加在檢測(cè)試紙A區(qū)，或?qū)z測(cè)試紙A區(qū)插入待檢尿液中，通過層析作用待檢尿液向B區(qū)移動(dòng)，流經(jīng)G區(qū)時(shí)將膠體金標(biāo)記HCG抗體從玻璃纖維上復(fù)溶，若待檢尿液中含有HCG，即形成膠體金標(biāo)記抗體-HCG復(fù)合物；上述復(fù)合物遷移至T區(qū)時(shí)，可被固相HCG抗體識(shí)別結(jié)合，形成固相HCG抗體-HCG-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物，膠體金聚集呈現(xiàn)陽性紫紅色檢測(cè)線；剩余膠體金標(biāo)記抗體遷移到C區(qū)與兔抗鼠IgG抗體二抗結(jié)合，膠體金聚集呈現(xiàn)紫紅色質(zhì)控線。 測(cè)試紙條出現(xiàn)兩條紫紅色反應(yīng)線：為早孕陽性；測(cè)試紙條檢測(cè)線顏色弱于質(zhì)控線：為早孕弱陽性；測(cè)試紙條僅在質(zhì)控線呈現(xiàn)紫紅色條帶：為早孕陰性；測(cè)試

8、紙條質(zhì)控線處無紫色條帶出現(xiàn)：為試驗(yàn)無效。Chemiluminescence immunoassay標(biāo)記物：魯米諾等。是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。先將抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入含有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法: Before centrifugeAfter centrifugeFig.1Fig.21. 玻璃粘附法2. 尼龍毛分離法3. E花結(jié)分離法T細(xì)胞羊紅細(xì)胞 （immune magnetic bead, IMB） 將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗

9、體交聯(lián)在磁性微珠上，與細(xì)胞懸液作用后置于磁場(chǎng)中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細(xì)胞分開。細(xì)胞用熒光素標(biāo)記的抗體染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)T細(xì)胞總數(shù): 抗CD3 檢測(cè)CD4+/ CD8+T細(xì)胞: 抗CD4/CD8檢測(cè)B細(xì)胞: 抗SmIg（一（一T細(xì)胞功能測(cè)定：細(xì)胞功能測(cè)定：1. T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)細(xì)胞增殖試驗(yàn)：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 觀察在有絲分裂原觀察在有絲分裂原PHA、Con A或特異性或特異性抗原刺激下抗原刺激下T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞免疫功能。細(xì)胞的增殖反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞免疫功能。用用3H-TdR法、法、MTT法測(cè)法測(cè)T細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖。2. 遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)：例如遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)：例如OT試驗(yàn)試驗(yàn) 1. 血清免疫球蛋白含量測(cè)定2. 抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)3. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)ELISPOT）溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn)溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn) Tc和和NK對(duì)其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用。對(duì)其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用。 方法：方