蛋白提取方法(共4頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 組織和細(xì)胞的來(lái)源： 1.1.2 儀器設(shè)備 機(jī)械組織勻漿器 低溫高速離心機(jī) (>40,000 g) 超速離心機(jī) 超生細(xì)胞破碎儀 超純水裝置 1.1.3 試劑 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫蘇糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考馬斯亮藍(lán)R350 抑肽素A 亮肽素 試劑純度均應(yīng)是分析純或以上。1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl調(diào)pH至7.4，用純水定容至1 L； (2)

2、 EDTA 儲(chǔ)存液： 18.61 g Na2EDTA2H2O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml?？筛邏簻缇蠓盅b備用； (3) 亮肽素儲(chǔ)存液 (50 g/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用時(shí)配成50 g/ml儲(chǔ)液，-20保存； (4) 抑肽素儲(chǔ)存液 (70 g/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用時(shí)配成70 g/ml儲(chǔ)液，-20保存； (5) PMSF儲(chǔ)存液 (10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，

3、-20 保存。 DTT 儲(chǔ)存液 (1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理，可過(guò)濾除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

4、 Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 L SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tri

5、s-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。蛋白酶抑制劑混合物3  成分  終濃度蛋白酶抑制劑混合物  PMSF  35 g/ml or 1 mM  EDTA  0.3 mg/ml (1 mM)   抑肽素  0.7 g/ml  亮肽素  0.5 g/ml1.2 方法 1.1.1組織蛋白提取方法1.2.1.1三

6、氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1)冰上取材，稱濕重，置液氮中凍存或直接進(jìn)行下一步； (2)在液氮中研碎樣品或使用機(jī)械勻漿器磨碎組織； (3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白20沉淀過(guò)夜； (5)35000×g(6)離心30min； 將沉淀重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中； (7)-20放置1h； 35000×g(6)離心30min； (9)在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）； (11)15,40000×g，離心1hr； (12)用B

7、radford法2測(cè)定上清的蛋白濃度，分裝后置75保存。 1.2.1.2超速離心法 (1)取材； (2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s； (3)組織懸液15，10000×g離心10min； (4)上清液4，×g超速離心45min； (5)小心避開上層漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清640,000g再次離心50min； 取離心上清。Bradford法定量，分裝后置75保存。 1.2.2培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取 1.2.2.1循環(huán)凍融法 (1)吸出培養(yǎng)液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于

8、10ml離心管中； (3)500×g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500×g，5min）， (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中； 執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序8，500×g5min離心； (7)用200l微量加液器吸出PBS，棄去； 吸干殘留的PBS，估計(jì)樣品體積，加入5倍體積裂解液，巴氏滴管混勻，液氮中反復(fù)凍融三次(每次置液氮中3s，室溫融化)，DTT在第一次凍融后加入； (9)執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序6，15，40000×g，離心1hr(Biofuge)； (10)上清Bra

9、dford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?1.2.2.2超聲破碎法 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液棄去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于10ml離心管中； (3)室溫，500×g，離心5min； (4)棄上清，PBS洗3次（室溫,500×g，5min）； (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g離心5min； 吸干殘留的PBS，估計(jì)樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞（3×10s）； (7

10、)15,40000×g，離心1hr(Biofuge)； 上清Bradford法定量，沉淀-75保存?zhèn)溆谩?2結(jié)果和討論 蛋白質(zhì)提取的基本步驟包括清洗組織或細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心除去膜組分等獲得溶解的蛋白質(zhì)上清。 我們破碎細(xì)胞采用循環(huán)凍融法和超聲波法；破碎組織采用液氮研磨法和機(jī)械勻漿法。循環(huán)凍融法操作簡(jiǎn)便，比較適合提取培養(yǎng)細(xì)胞的穩(wěn)定蛋白，我們后期實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞主要采取這種破碎方式。使用超聲破碎必須注意的是控制強(qiáng)度在一定限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。因?yàn)楫a(chǎn)生泡沫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同時(shí)要注意散熱。勻漿是機(jī)體軟組織破碎最常用的方法之一。由于勻漿過(guò)程中蛋白質(zhì)被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡(jiǎn)便、迅速和風(fēng)險(xiǎn)小的組織破碎方法，我們實(shí)驗(yàn)室在破碎腦和脊髓組織時(shí)常用此法；由于神經(jīng)組織比較柔軟，液氮研磨法也很適合，本實(shí)驗(yàn)中我們使用了這一方法破碎大鼠脊髓組織，中樞神經(jīng)組織由于富含脂類，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類干擾物質(zhì)有效分離，但沉淀法的缺點(diǎn)是再溶解時(shí)蛋白損失嚴(yán)重。高速離心的缺點(diǎn)是需要樣品量大，如BeckmanL7-65超速離心機(jī)的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。 在眾多的裂解液配方中，我們主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質(zhì)加蛋白酶抑制劑混合物，原因是這一配方經(jīng)長(zhǎng)期使用很穩(wěn)定，裂解效率也較高，非常適合小量細(xì)