內(nèi)毒素體外誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡

1、    內(nèi)毒素體外誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡        【摘要】目的探討內(nèi)毒素在體外直接作用于大鼠肝細(xì)胞時(shí)，肝細(xì)胞所發(fā)生的病理及生物化學(xué)特性的變化。方法采用膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞，體外培養(yǎng)后在培養(yǎng)基中直接加入內(nèi)毒素，用光鏡和透射電鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化；提取肝細(xì)胞的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察肝細(xì)胞生物化學(xué)性質(zhì)的改變。結(jié)果內(nèi)毒素直接作用的肝細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出染色質(zhì)凝集等凋亡細(xì)胞的特征；在生物化學(xué)方面表現(xiàn)典型的凋亡梯形，此過程可以被凋亡抑制劑金紅三羧酸(aurintricarbox

2、ylic acid, ATA)抑制。肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量隨內(nèi)毒素劑量的增加而增加，并且在處理前24小時(shí)之內(nèi)隨處理時(shí)間的延長而增加。結(jié)論內(nèi)毒素在體外直接作用于肝細(xì)胞，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡?！娟P(guān)鍵詞】內(nèi)毒素脂多糖凋亡肝細(xì)胞Lipopolysaccharide-induced apoptosis of rat hepatocyte in vitroLIANG Xiubin, QIAO Zhongdong, YIN Lei, et al.Shanxi Medical University, Division of Pathophysiology, Taiyuan 030001【Abstract】 Obje

3、ctives To investigate the effect of lipopolysaccharide(LPS) on hepatocyte in vitro. Medthods The hepatocytes were isolated in the way of liver perfusion with 0.05% collagenase type I and type , and cultured for 24h in vitro before LPS was added directly into the culturing medium. Propidium iodide(PI

4、) staining, and transmission electron microscopy techniques had been used to observe the morphological changes of hepatocyte treated with LPS. DNA-fragment assay was analyzed by the agarose gel electrophoresis to determine apoptostic level. Results Hepatocytes incubated with LPS exhibited some typic

5、al apoptosis-specific morphological features. The DNA-fragment by agarose gel electrophoresis demonstrated the typical ladder pattern on the hepatocytes directly exposed to LPS, but it was absent in the group used ATA, an inhibitor of apoptosis. These morphological changes, accompanied by DNA fragme

6、ntation assay, confirmed that cells were dying through an apoptotic pathway. In addition, the hepatocyte number of apoptosis increased parallel with the dose of LPS and time within 24h when hepatocytes were exposed to LPS alone. Conclusions LPS can induce apoptosis of hepatocyte in vitro.【Key words】

7、 Endotoxin Lipopolysaccharide Apoptosis Hepatocyte內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌莢膜的脂多糖(lipo-polysaccharide, LPS)。在內(nèi)毒素直接作用下，肝細(xì)胞將發(fā)生什么樣的變化？它對(duì)肝細(xì)胞是毒性作用還是其它作用，目前尚不清楚。我們觀察了內(nèi)毒素在體外的直接作用下，肝細(xì)胞所發(fā)生的變化。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠，雄性，體重200g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2.肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：采用Seglen1法分離肝細(xì)胞。肝細(xì)胞懸液的密度為2×105/ml。37體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。用臺(tái)盼藍(lán)染色法顯示細(xì)胞活性

8、，本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞活性均在90%以上。3.肝細(xì)胞的處理：將肝細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，分以下幾組：劑量系列組肝細(xì)胞分別以5mg/L, 10mg/L, 20mg/L, 40mg/L四種不同濃度的LPS處理，時(shí)間均為20小時(shí)；時(shí)間系列組肝細(xì)胞均用10mg/L的LPS處理，并分別在3小時(shí),6小時(shí),12小時(shí),24小時(shí)等四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集肝細(xì)胞；LPS+ATA組中LPS的劑量均為10mg/L, ATA為100mol/L，均作用20小時(shí)。上述各處理組都同時(shí)設(shè)不作任何處理的正常對(duì)照組。4.碘化丙錠(PI)染色：用細(xì)胞刮勺將培養(yǎng)好的細(xì)胞(2×106)刮起，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心棄上清液，PBS漂洗后，固定于體

9、積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中，再經(jīng)離心漂洗，重懸于4mlPI染液中，置4避光染色30分鐘后，涂片在熒光顯微鏡下觀察。5.透射電鏡觀察：肝細(xì)胞同上收獲后，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心棄上清液，用PBS漂洗，2%戊二醛(pH7.4)固定，經(jīng)1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗，1%四氧化鋨固定，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋后，樣品切片經(jīng)染色載于銅網(wǎng)上，在透射電鏡下觀察。6.DNA片段的提?。翰捎肕oore等2方法提取培養(yǎng)細(xì)胞的DNA片段。提取片段經(jīng)空氣干燥后溶于20l的雙蒸水中，4保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果1.肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化：用PI對(duì)LPS處理組肝細(xì)胞及正常組肝細(xì)胞染色后，熒光顯微鏡下可見經(jīng)LPS處理后肝細(xì)胞細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞

10、核出現(xiàn)凹溝，有的細(xì)胞核分裂成數(shù)個(gè)小核，而正常細(xì)胞核為圓型，周邊整齊光滑，符合細(xì)胞凋亡的光鏡特征。透射電鏡下經(jīng)LPS處理后，肝細(xì)胞的細(xì)胞核電子密度較高，染色質(zhì)固縮，聚集于核膜，呈境界分明的塊狀或新月狀小體，有的細(xì)胞凹入細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞器包裹形成所謂的凋亡小體，與細(xì)胞凋亡的特征相符。2.肝細(xì)胞生物學(xué)特性的變化：在培養(yǎng)基中加入了LPS(10mg/L)以后明顯可見是梯形分布的DNA條帶；再加入ATA后，梯形分布的DNA條帶的亮度與正常對(duì)照組接近，說明LPS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且又可以被ATA抑制。在培養(yǎng)基分別加入0mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L LPS，并處理20小時(shí)，當(dāng)沒

11、有LPS時(shí)，不出現(xiàn)凋亡梯形，而其它四個(gè)劑量組卻隨著LPS劑量的增高，凋亡梯形的亮度也增高。凋亡的肝細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)基中LPS的劑量增加而增加(1)。1.Markers,2.Control,3.LPS5mg/L,4.LPS10mg/L,5.LPS20mg/L,6.LPS40mg/L1不同劑量的對(duì)LPS肝細(xì)胞凋亡的影響當(dāng)恒定了LPS的劑量(10mg/L)以后，分別在0小時(shí),3小時(shí),6小時(shí),12小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)之內(nèi)肝細(xì)胞隨LPS作用時(shí)間的延長凋亡細(xì)胞的數(shù)量也在增加，而且在LPS作用肝細(xì)胞3小時(shí)就表現(xiàn)出明顯的凋亡梯形，在LPS作用肝細(xì)胞的早期就可以有細(xì)胞凋亡的發(fā)生(2)。1.M

12、arkers,2.Control,3.LPS3h,4.LPS6h,5.LPS12h,6.LPS242LPS在不同處理時(shí)間對(duì)肝細(xì)胞調(diào)亡的影響討論在LPS的直接作用下，肝細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特征；在生物化學(xué)方面，也表現(xiàn)出典型的凋亡梯形。而且這一過程可以被凋亡抑制劑ATA所抑制。肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量與LPS的劑量成正比；在用LPS處理24小時(shí)之內(nèi)肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量也與時(shí)間成正比。這說明LPS可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，且此作用在處理早期明顯。Leist等3證實(shí)了無論是用LPS還是腫瘤壞死因子處理半乳糖胺（或放線菌素D）致敏鼠造成的肝損傷早期均表現(xiàn)為凋亡特征，晚期則凋亡和廣泛的細(xì)胞壞死同時(shí)發(fā)生。當(dāng)

13、在電鏡下觀察到凋亡小體時(shí)，血清中轉(zhuǎn)氨酶水平還未見升高，說明在肝損傷時(shí)，早期發(fā)生細(xì)胞凋亡，晚期為細(xì)胞壞死。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。本課題受山西省歸國留學(xué)人員啟動(dòng)基金資助作者簡介：梁秀彬女，27歲，碩士，主治醫(yī)師。作者單位：梁秀彬喬中東尹鐳趙嘉惠（030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；韓德五（病理生理學(xué)教研室）參考文獻(xiàn)1 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol, 1976, 13: 79-83.2 Moore KJ, Matlashewski G. Intracellular infection by leishmania-donovani inhibits macrophage apoptosis. J Immunol, 1994, 152: 2930.3 Leist M, Gantner F