桑黃胞外多糖對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

1、·84·2014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，桑黃胞外多糖對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用蔡國云，張李金鳳，艷，水冰潔，范永升，丁興紅杭州310053）將60只Wistar大浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（浙江【摘要】目的研究桑黃胞外多糖對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠的治療效果，并探討其治療機制。方法鼠隨機分為空白組，模型組，陽性對照組，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組，每組10只，連續(xù)給藥30天。采用組織容積法測定關(guān)節(jié)腫脹ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-程度，關(guān)節(jié)病理切片觀察關(guān)節(jié)組織病理情況，（TNF-）、白介素-1（IL-

2、1）、白介素-17（IL-17）的表達水平。結(jié)果與空白組比較，模型組各指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。與模型組比較，各治療組均能抑制非致炎足足趾腫IL-1、IL-17的表達（P005）。與陽性藥對照比較，脹（P005），桑黃胞外多糖改善關(guān)節(jié)組織病理情況，顯著降低血清中TNF-、IL-1、IL-17的表達及桑黃胞外多糖低劑量組TNF-IL-1的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多高、中劑量組TNF-、IL-1的表達與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。結(jié)論糖高劑量組血清中TNF-、果，其作用機制可能是通過抑制NF-B信號通路和炎癥細胞因子的表達來實現(xiàn)的。【關(guān)鍵詞】桑黃胞外多糖；膠原誘

3、導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；腫瘤壞死因子-；白介素-1；白介素-17【中圖分類號】2855【文獻標志碼】A【文章編號】1007-1334（2014）09-0084-04桑黃胞外多糖對CIA大鼠有一定的治療效ImmunoregulatoryeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritisratsLIJin-feng，CAIGuo-yun，ZHANGYan，SHUIBing-jie，F(xiàn)ANYong-sheng，DINGXing-hongZhejiangChineseMedicalUniversity，

4、HangzhouAbstract：ObjectiveToexplorethetherapeuticeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritis（CIA）ratsMethodsSixtyWistarratswererandomlydividedinto6groups：blankgroup，modelgroup，controlgroup，3treatmentgroupswithPhellinusigniariusextracellularpolysaccharide，with10r

5、atsineachgroup，andtheratswerecontentiouslyadministratedfor30daysThepawvolumewasmeasuredtodeterminejointswellingdegreeThepathologicalsectionsofanklewereobservedundermicroscopeThelevelsofTNF-，IL-1，IL-17weredeterminedbyELISAesultsThereweresignificantdifferencesintheindexesbetweentheblankgroupandthemode

6、lgroup（P005）Comparedwiththemodelgroup，eachtreatmentgroupcandecreasethepawswellingdegree（P005），improvejointtissuepathologicalsituation，decreasethelevelsofTNF-，IL-1，IL-17significantly（P005）Comparedwiththepositivedruggroup，nosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-，IL-1andIL-17inhighdoseandm

7、ediumdosegroups，andTNF-andIL-1inlowdosegroup（P005）NosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-andIL-1betweenhighdosegroupandblankgroup（P005）ConclusionPhellinusigniariusextracellularpolysaccharidehasatherapeuticeffectonCIArats，anditsmechanismmaybethroughinhibitingtheexpressionofNF-Bpathwayan

8、dtheexpressionofinflammatorycytokinesKeywords：Phellinusigniariusextracellularpolysaccharide；collagen-inducedarthritis；TNF-；IL-1；IL-17A）是一種以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病，其主要病變特點是由滑膜炎引起的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。本病是一種常見風(fēng)濕免疫病，1全世界發(fā)病率約為05%1%。目前，非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質(zhì)激素等是治療本病的主要藥物，可基金項目浙江省自然科學(xué)基金資

9、助項目（LY14H270014）作者簡介李金鳳，女，碩士生，主要從事微生物與生化藥學(xué)方面研究工作。通訊作者丁興紅，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：zmkm1978126com以在一定程度上減輕由炎癥引起的疼痛，但也存在明2顯的毒副作用，導(dǎo)致患者的依從性差。多糖作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，在治療近年來，3和預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面取得了積極進展。桑黃是4具有一種珍貴的藥用真菌，其主要活性成分為多糖，56可用于治療自身抗炎等功效，抗腫瘤、保肝護肝、7免疫性關(guān)節(jié)炎。本研究以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠為模型，觀察桑黃胞外多糖對CIA大鼠足趾腫脹度、血清中腫瘤壞死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）

10、、白介素-17（IL-17）的影響，并探討桑黃胞外多糖治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機制，為桑黃多糖臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。2014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，·85·1材料與方法11材料111動物6周齡清潔級Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量130160g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。112藥物與試劑桑黃（Phellinusigniarius），購于美國典型菌種保藏中心ATCC（編號：36121）?？ń槊?，無錫上海生物制品研究所（批號：200703001）；石蠟油，江蘇永海

11、碩生物有限公司（批號：20101123）；羊毛脂，華精細化學(xué)品有限公司（批號：20110305）；BovineTypeChondrex（批號：20022）；塞來昔布，輝瑞制Collagen，IL-1、IL-藥有限公司（批號：BK12CCEK107）；TNF-、17試劑盒，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。113儀器電子天平（BS124S），賽多利斯科學(xué)儀器Sanyo；冷凍恒溫振有限公司；高壓滅菌鍋（MLS-3750），D），蕩器（DHZ-太倉市實驗設(shè)備廠；酶標儀（MK3），ThermoMultiskan；振蕩器（QB8002），Qilinbeier；渦旋混Qilinbeier；離心機（LX200），Qil

12、inbeier；足合器（KB3），趾容積測量儀（YLS-7B），安合盟（天津）科技有限公司。12藥物制備將桑黃（Phellinusigniarius）菌種22、160r/min培養(yǎng)710天。按參考文獻8方法，抽濾獲得不含菌絲體發(fā)酵液，減壓濃縮至1/5，加入4倍體積的無水乙醇使其終濃度為80%，4沉淀多糖8h，過濾沉淀洗滌，干燥得到桑黃胞外多糖。配制桑黃胞外多糖溶液，濃度分別為低（100g/g）、中（200g/g）、高（400g/g）。塞來昔布劑量為263g/g。13分組、造模及給藥將60只Wistar雄性大鼠隨機分為空白組，模型組，陽性對照組，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組，每組10只。取20m

13、l液體石蠟與10ml羊毛脂，加熱、超聲，使121高壓其混合均勻，制成弗氏不完全佐劑（IFA），4冰箱保存?zhèn)溆?。?mlIFA，滅菌60min，加入卡介苗，使其終濃度為5g/L。研磨均勻制成弗氏完全佐劑（CFA），加入等體積的BovineTypeCollagen（005mol/L醋酸溶解），制成牛C-冰浴研磨均勻，CFA乳劑。除空白組外，其余各組均在大鼠的右后足CFA乳劑致趾皮下和尾根部各注射01ml的牛C-7天后在大鼠尾根部注射01ml加強免疫，炎，空白組2則在相應(yīng)的部位注射等量的09%NaCl溶液。模型組灌造模后第15天開始灌胃給藥：空白組、胃09%NaCl溶液，陽性對照組灌胃塞來昔布263

14、g/g，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組分別灌胃相應(yīng)的劑量的桑黃胞外多糖溶液。每只大鼠每天灌胃1次，每次2ml，連續(xù)給藥30天。14取材及指標檢測141大鼠形態(tài)觀察采用關(guān)節(jié)指數(shù)評分法9（0分1分表示個別足趾發(fā)紅、2分表示腫脹，表示無關(guān)節(jié)炎，3分表示踝關(guān)節(jié)及以下腫脹，大部分足趾及足底腫脹，4分表示腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上且不能負重，四肢關(guān)節(jié)最高得分為16分，大于4分認為關(guān)節(jié)炎癥誘導(dǎo)成功）評價CIA大鼠造模成功與否。142大鼠關(guān)節(jié)病理給藥30天后，將大鼠麻醉處死，截取大鼠非致炎足左后肢，做關(guān)節(jié)病理切片（HE染色），顯微鏡觀察大鼠的關(guān)節(jié)組織病理情況。143大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度給藥前1天采用足趾容積測量法測定大鼠足

15、趾腫脹容積，給藥后每隔4天測定一次。通過各組大鼠的足趾容積的差異來評價各給藥組的治療效果。144大鼠血清細胞因子含量給藥30天后，將大3000r/min離鼠麻醉，腹主動脈取血，靜置30min后，ELISA法測定TNF-IL-1、心10min，取上層血清，、IL-17含量。15統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS190統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果21大鼠形態(tài)觀察除空白組外，各組大鼠造模第1天右后足出現(xiàn)原發(fā)性腫脹，第14天出現(xiàn)繼發(fā)性腫脹。造模后大鼠右后足關(guān)節(jié)腫脹明顯，并逐漸累及左后足及前肢關(guān)節(jié)，嚴重時雙后足不能負重，飲

16、食及活動減少，體質(zhì)量增長較慢，毛色無光澤，關(guān)節(jié)評分均大于4分，確定造模成功。22大鼠關(guān)節(jié)組織的病理觀察空白組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞一般為13層，排列致密有序。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞明顯增多，且出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤，有血管翳生成，與關(guān)節(jié)軟骨組織粘連，造成軟骨侵蝕和破壞，表明造模成功。陽性對照組中，滑膜與軟骨粘連情況明顯減輕，且侵入軟骨腔的滑膜逐漸退出，滑膜細胞增生和炎癥浸潤也有所減少。桑黃胞外多糖低劑量組滑膜與軟骨粘連比較嚴重，中劑量組中粘連情況有所減輕但軟骨表面仍不光滑，高劑量組的病變情況較模型組和低、中劑量組明顯減輕，滑膜細胞數(shù)量和血管翳較模型組減少，軟骨的侵蝕和破壞程度也有所減輕，且軟骨表

17、面較光滑。見圖1。23對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響開始給藥后824天期間各給大鼠左后足足趾腫脹程度開始降低，藥組與模型組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。陽性對照組抑制效果最為明顯，在820天期間與胞外多糖低、中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖低、中、高劑量組抑制大鼠足趾腫脹程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。第24天桑黃胞外多糖高、中劑量組與陽性對照組足趾腫脹程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005），而桑黃胞外多糖低劑量組與陽性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。第28天各給藥組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。見表1。·86·2014；Vol48

18、No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，注：A空白組；B模型組；C陽性對照組；D胞外多糖低劑量組；E胞外多糖中劑量組；F胞外多糖高劑量組表1×200)圖1大鼠關(guān)節(jié)病理組織觀察(HE，±s，ml)各組CIA大鼠足趾腫脹程度比較(n=10組別空白組模型組陽性對照組0d1086±07012002±0176*1926±0153*2008±0270*1979±0180*1915±0100*16d1162±00611654±0087*1274±0086*1476±

19、0134*1400±0055*1394±0065*#4d1074±00921975±0234*1804±0125*1924±0246*1828±0112*1818±0084*20d1190±00751438±0078*1221±0063#1366±0093*1308±0094*1298±0068*#8d1070±00751817±0126*1516±0083*1692±0228*1667±0101*1664

20、±0133*24d1191±00551375±0041*1186±0049#1299±0096*1241±0088#1239±0038#12d1102±00331695±0103*1320±0121*1580±0182*1469±0068*1460±0091*28d1221±01301318±0082*1155±0073#1222±0108#1213±0083#1208±0047#桑黃胞外多糖低劑量組桑黃胞

21、外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組組別空白組模型組陽性對照組桑黃胞外多糖低劑量組桑黃胞外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組*P005；與模型組同期比較，#P005；與陽性對照組同期比較，注：與空白組同期比較，P00524對大鼠血清中細胞因子的影響與空白組比較，IL-1、IL-17含量顯著升高，模型組大鼠血清中TNF-、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。與模型組比較，陽性對照組和桑黃胞外多糖高、中、低劑量組大鼠血清中TNF-IL-1、IL-17含量降低，、差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖各劑量組血清中TNF-含量與陽性對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P005），且桑黃胞外多糖高劑量組與空白組

22、差異無統(tǒng)計學(xué)意義n=10，ng/L)表2各組大鼠血清細胞因子含量比較(±s，組別空白組模型組陽性對照組桑黃胞外多糖低劑量組桑黃胞外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組TNF-3216±2133807±114*3544±257*3597±197*3585±260*#（P005）。桑黃胞外多糖各劑量組血清中IL-1含量與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖高、中劑量組血清中IL-17含量與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。與桑黃胞外多糖低劑量組IL-1含量差異比較，桑黃胞外多糖高劑量組TNF-、有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。

23、與桑黃胞外多糖中劑量組比較，桑黃胞外多糖高劑量組TNF-含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）。見表2。IL-15729±2556840±286*5782±282#6004±323*5795±221#5633±234#IL-173415±1624012±315*3546±256#3736±141*3676±139*3597±139*#3370±254#*P005；與模型組比較，#P005；與陽性對照組比較，P005；與胞外多糖低劑量組比較，P005；與胞外多糖中劑量組注：

24、與空白組比較，比較，P0052014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，·87·3討論類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中多種細胞因子關(guān)系密IL-1等基因的轉(zhuǎn)錄水平，通路，降低TNF-、并通過抑IL-1、IL-17細胞因子的表達，制TNF-、降低Th細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的免疫應(yīng)答，起到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。本研究表明，桑黃胞外多糖對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎有一定的治療效果，為臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了一定的理論依據(jù)。參考文獻：左曉霞，1EdwardD，HarrisJr凱利風(fēng)濕病學(xué)M陶立堅，高潔生，2006：853-877譯北京：人民衛(wèi)生出版社，2谷

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