增骨丸對維甲酸誘導的大鼠骨質(zhì)疏松模型影響的實驗研究

1、增骨丸對維甲酸誘導的大鼠骨質(zhì)疏松模型影響的實驗研究【摘要】 目的：探討中藥復方制劑增骨丸對維甲酸誘導的大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響。方法：將50只8月齡雌性SD大鼠隨機分為2組：正常組(13只)、骨質(zhì)疏松組(37只)。模型復制成功后，把骨質(zhì)疏松組隨機分為3組：模型組、乙烯雌酚組、增骨丸組。觀察增骨丸對模型大鼠血清雌二醇（E2）、骨鈣素（BGP）、堿性磷酸酶（AKP）、血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、鈣（Ca）、磷（P）及尿中鈣（U|Ca）、羥脯氨酸（U|HOP）、尿肌酐(U|Cr)的影響。結(jié)果：增骨丸組與模型組比較，血清E2、BGP、AKP顯著升高（P0.05）；TRAP、 U|Ca、U|HOP

2、含量及U|Ca/U|Cr、U|HOP/U|Cr值明顯下降（P0.05或P0.01）。結(jié)論：增骨丸對骨質(zhì)疏松有良好的治療作用，其機理可能是一定程度地提高了體內(nèi)的雌激素水平，抑制骨的吸收，影響骨的形成。中藥增骨丸可通過體內(nèi)多方面調(diào)節(jié)作用，達到制骨質(zhì)疏松的發(fā)展，具有良好的應用前景。 【關(guān)鍵詞】 增骨丸；維甲酸；骨質(zhì)疏松癥；實驗研究 骨質(zhì)疏松(Ostteoporosis,簡稱OP)是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高而骨折危險性增加的系統(tǒng)性多病因的一種全身骨骼疾病1-2。臨床表現(xiàn)腰背痛、身體畸形、骨折等。由于世界人口的老齡化，致使該病發(fā)病率逐年升高，且合并嚴重并發(fā)證， 對個人、家庭

3、、社會構(gòu)成嚴重的負擔。因此，對OP的研究已成為一個世界性醫(yī)學課題。增骨丸是在中醫(yī)辨證論治理論的指導下，根據(jù)骨質(zhì)疏松癥病理特點，由甘肅省中醫(yī)骨傷科專家宋貴杰老教授擬定的中藥復方，經(jīng)30余年來臨床觀察，對治療骨質(zhì)疏松癥療效肯定，并已有相關(guān)科研報道。為了進一步研究該方對OP的作用機制，我們做了增骨丸對維甲酸誘導的骨質(zhì)疏松大鼠模型影響的實驗研究。1 材料與方法1.1 實驗動物8月齡健康未交配Sprague Dawley(SD)大鼠50只，體重250280g，購自青海省實驗動物中心。1.2 藥物及試劑盒增骨丸煎液：由甘肅省中醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科制備，常規(guī)煎煮，減壓濃縮，藥液質(zhì)量濃度為每mL含生藥2.67

4、 g，冷藏備用。乙烯雌酚：購自甘肅省中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，由天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號2020154，每片1 mg，使用時研磨以蒸餾水配制成0.01 mg/ml的藥液灌胃。維甲酸：購自重慶華邦制藥股份有限公司，批號0950191，每個膠囊20 mg，使用時研磨以蒸餾水配制成10 mg/ml的混懸液灌胃，現(xiàn)配現(xiàn)用。BGP放免試劑盒、E2放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)），TRAP試劑盒、AKP試劑盒、Ca試劑盒、P試劑盒、HOP試劑盒、 Cr試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）。1.3 主要儀器LG-3A高速冷凍離心機（北京醫(yī)用離心機廠）、VIS-7220型可見分光光度儀（北京第二光學

5、儀器廠）、SN-695B型智慧放免測量儀（上海原子能研究所日環(huán)儀器廠）、CX全自動生化分析儀(美國Beckman公司生產(chǎn))。1.4 實驗方法1.4.1 動物的分組和造模實驗前適應性喂養(yǎng)10 d，將50只大鼠按體重隨機分為2組：一組為正常組13只，以蒸餾水灌胃，1次d，3 mL次。另一組為骨質(zhì)疏松組37只，每只每天給予維甲酸按70?J?K灌胃14 d，1次d。在第15 d兩組各處死5只大鼠取材（脛骨），觀察模型復制情況。1.4.2 給藥與飼養(yǎng)所有動物在統(tǒng)一條件下（室溫1924 ，相對濕度40 %左右），普通飼料喂養(yǎng)（由蘭州大學醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供），自由飲水。造模成功后進入45 d的治療階段，

6、給藥劑量按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量。因兩組各處死5只大鼠，加之在造模及喂養(yǎng)過程中因不明原因骨質(zhì)疏松組又死亡2只，故正常組為8只，骨質(zhì)疏松組為30只。再將骨質(zhì)疏松組隨機分為3組：模型組10只，灌蒸餾水3 mL/次；增骨丸組10只，按5 g/（?K?d）劑量灌胃45 d；乙烯雌酚組10只，按0.86 mg/（?K?d）劑量灌胃。各組大鼠每周灌胃6次，連續(xù)灌胃45 d。1.4.3 取材與處理灌藥第46 d處死大鼠，處死前用電子臺秤稱其重量。股動脈取血35 mL，置37 水浴箱中2 h，待血清分離后離心（2000 r/min），取大鼠血清置-20 低溫冰箱保存待測。處死前1 d，分別置大鼠于代

7、謝籠中，收集24 h空腹尿液，置-20 低溫冰箱中備用。1.4.4 檢測指標和方法放免法測血清BGP及E2含量。采用偶氮胂法測定血清鈣及尿鈣(S|Ca、U|Ca ，mol/L)，磷鉬酸法測定血清磷(S|P, mol/L)，比色法測定血清堿性磷酸酶(S|AKP,IU/L)，用比色法測定血清抗酒石酸酸性磷酸酶(S|TRAP,IU/L)，用苦味酸法測定尿肌酐（U|Cr,umol/L)，用氯安T法測定尿羥脯氨酸(U|HOP,mg/L)，并計算U|Ca/U|Cr值、U|P/U|Cr值、U|HOP/U|Cr值。1.4.5 統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均輸入計算機，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量數(shù)據(jù)所有數(shù)據(jù)

8、用均數(shù)標準差（）表示，采用LSD法進行顯著性檢驗。2 結(jié)果2.1 模型復制情況2.1.1 一般表現(xiàn)造模期間骨質(zhì)疏松組動物出現(xiàn)進食減少，體毛枯疏，反應遲鈍，口唇炎，結(jié)膜充血，體重減輕等不良反應的表征。2.1.2 模型期各組大鼠血清E2 、AKP、 BGP、TRAP含量結(jié)果比較見表1。表1 模型期各組大鼠血清E2、AKP、 BGP、TRAP含量結(jié)果比較（略）注：與正常組比較*P0.05，* P0.01 表1顯示，骨質(zhì)疏松組大鼠血清E2水平明顯降低(P0.01)，TRAP活性明顯升高(P0.01)，表明維甲酸誘導大鼠骨質(zhì)疏松致性腺損傷、萎縮，使血清E2明顯降低，雌激素水平下降，對破骨細胞的抑制作用降

9、低，使骨吸收增強。骨質(zhì)疏松組血清AKP明顯高于正常組(P0.05)，表明成骨細胞活性增強，反映了骨改建的活躍狀態(tài)。血清AKP的升高可能是骨吸收亢進伴隨著成骨細胞功能活躍的結(jié)果。骨質(zhì)疏松組血清BGP顯著高于正常組(P0.05)，說明骨丟失處于快速時相期，由于骨吸收和骨形成的偶聯(lián)作用，具有修復和代償作用的骨形成增多。2.1.3 模型期各組大鼠U|Ca、U|HOP含量及U|Ca/|UCr、U|HOP/U|Cr值的結(jié)果比較見表2。表2 模型期各組大鼠U|Ca、U|HOP含量及U|Ca/U|Cr、U|HOP/U|Cr值的結(jié)果比較（略）注：與正常組比較*P0.05，*P0.01 由表2 可以看出，骨質(zhì)疏松

10、組大鼠U?CCa 含量、U|Ca/U|Cr值高于正常組（P0.05或P0.01），說明維甲酸誘導大鼠骨吸收增加，骨鈣丟失嚴重，尿鈣排除增多；骨質(zhì)疏松組大鼠U|HOP含量、U|HOP/U|Cr值明顯高于正常組（P0.01），說明維甲酸誘導大鼠骨吸收增加，骨基質(zhì)丟失嚴重。2.2 給藥后各組情況2.2.1 各組大鼠血清E2 、TRAP、BGP含量結(jié)果比較見表3。表3 各組大鼠血清E2 、TRAP、 BGP含量結(jié)果比較（略）注：與模型組比較P0.05，P0.01；與增骨丸組比較?P0.05 表3顯示，模型組血清E2含量較其他組明顯下降（P0.05或P0.01），動物模型符合雌激素水平大幅下降的特點。增

11、骨丸組E2水平明顯低于正常組和乙烯雌酚組（P0.05），提示增骨丸僅有弱雌激素樣作用。血清TRAP含量模型組與各組比較明顯升高（P0.05或P0.01），乙烯雌酚組和增骨丸組較模型組明顯降低（P0.05），說明增骨丸有類似乙烯雌酚樣作用，抑制骨吸收。模型組血清BGP含量與各組比較明顯降低（P0.05或P0.01），說明維甲酸誘導大鼠成骨活動減弱,增骨丸有促進骨形成的作用。2.2.2 各組大鼠血清AKP、Ca、P含量結(jié)果比較見表4。表4 各組大鼠血清AKP、Ca、P含量結(jié)果比較（略）注：與模型組比較P0.05；與增骨丸組比較?P0.05），可能是代償性的增加，與乙烯雌酚組和增骨丸組比較有顯著性差

12、異（P0.05），說明大鼠灌服增骨丸和乙烯雌酚后，其血清Ca、P變化不大。2.2.3 各組大鼠U|Ca、U|HOP含量U|Ca/U|Cr、U|HOP/U|Cr值的結(jié)果比較見表5。表5 各組大鼠U|Ca、U|HOP含量U|Ca/U|Cr、U|HOP/U|Cr值的結(jié)果比較（略）780.400.340.0130.1300.0670.0570.013 注：與模型組比較P0.05，P0.01；與增骨丸組比較?P0.05，?P0.01 表5顯示，模型組U|Ca含量及U|Ca/U|Cr值與各組比較明顯升高（P0.05或P0.01），說明尿鈣排出增多，骨鈣丟失嚴重。U|HOP含量及U|HOP/U|Cr值各組與

13、模型組比較均有顯著性差異（P0.05或P0.01），表明增骨丸抑制骨基質(zhì)分解，減少骨鈣溶出，抑制骨吸收。3 增骨丸組方及方義增骨丸主要由淫羊藿、骨碎補、金毛狗脊、雞血藤、黃芪、木香、三七、桃仁、丹參、萆?Z組成。方中淫羊藿、金毛狗脊、骨碎補溫腎壯陽，共為君藥；黃芪、木香補氣健脾共為臣藥，其中木香有辛香之氣，以開胃助納，兼能止痛。雞血藤、桃仁、丹參活血止痛，補血養(yǎng)陰；三七化瘀止痛，為活血之藥；萆?Z祛風除濕，以驅(qū)趕外邪，共為佐藥。如此標本兼治，使髓得所養(yǎng)、骨得以生，兼有補肝脾腎、活血化瘀之功效。4 討論大量的臨床應用已證明中醫(yī)藥治療OP療效可靠，作用全面，開展這方面的實驗研究對于更好地指導中醫(yī)藥的運用十分必要。本實驗研究證明維甲酸誘導大鼠骨質(zhì)疏松致性腺損傷、萎縮，使血清E2明顯降低，雌激素水平下降，對破骨細胞的抑制作用降低，使骨吸收增強，它既增加成骨細胞的數(shù)量和活性，又刺激破骨細胞使其活性增強，導致骨吸收大于骨形成的類似骨高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。增骨丸可以升高維甲酸誘導的OP模型大鼠血清E2、BGP、AKP水平，降低OP TRAP、U|Ca