鹿茸多肽對(duì)β駁矸堊蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

1、鹿茸多肽對(duì)?駁矸堊?蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用                         作者：王旭凱 王英 楊有庚 冷向陽(yáng)【摘要】  目的探討鹿茸多肽對(duì)?駁矸堊?蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法體外進(jìn)行胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)傳代，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT比色法檢測(cè)不同濃度?駁矸堊?蛋白作用24 h后細(xì)胞活力變

2、化；檢測(cè)25molL ?駁矸堊?蛋白作用24 h后，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)和觀察細(xì)胞caspase?3表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度的?駁矸堊?蛋白作用24 h后對(duì)細(xì)胞活力均明顯下降，并呈劑量依賴性(P<0.05)；鹿茸多肽可明顯抑制?駁矸堊?蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(P<0.05)，且可使caspase?3的表達(dá)量下降。結(jié)論鹿茸多肽通過抑制?駁矸堊?蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase?3表達(dá)增高而對(duì)其細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)為探索新的治療脊髓神經(jīng)損傷的藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  鹿茸多肽 脊髓神經(jīng)細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 ?駁矸堊?蛋白 casepase?3脊髓損傷（

3、spinal cord injury，SCI）是外科常見的創(chuàng)傷，其年發(fā)病率逐年升高。在脊髓損傷中，除了原發(fā)的物理打擊因素造成神經(jīng)細(xì)胞損傷外，已發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)及臨近部位的神經(jīng)細(xì)胞存在遲發(fā)性的死亡現(xiàn)象，這種死亡與常見的壞死不同1，表現(xiàn)為一種程序性死亡（細(xì)胞凋亡），細(xì)胞凋亡可能參與了脊髓損傷的病理生理過程。caspase?3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，降低其的表達(dá)有助于脊髓損傷的修復(fù)和再生2。鹿茸系鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角3。關(guān)于鹿茸多肽混合物，近兩年，有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證明鹿茸多肽對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用4，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹿茸多肽作用于?駁矸堊?蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)

4、作用，以進(jìn)一步闡述其對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)理。1  實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)材料  15d孕鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購(gòu)自Castar公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）購(gòu)自Sigma公司；鹿茸多肽由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)惠贈(zèng)；?駁矸堊?蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自(Sigma公司)；兔多克隆caspase?3抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2  實(shí)驗(yàn)方法1.2.1  凝聚態(tài)A25-35的制備  用超純水

5、將凍干的A25-35溶解配成100 molL的儲(chǔ)存液，于-20 保存，使用前配成所需濃度，于37孵育24 h備用。1.2.2  胎鼠脊髓細(xì)胞懸液制備及培養(yǎng)  取孕15d大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，無(wú)菌狀態(tài)下取出胎鼠。用Hanks液沖洗數(shù)遍后，放于培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下從背側(cè)完全暴露腦干以下整條脊髓，從正中溝處用鎢絲針切除雙側(cè)脊髓的后外側(cè)部。將取下的脊髓腹側(cè)組織，經(jīng)Hanks液沖洗后，剝?nèi)ケ砻娴难艿?，用顯微剪子細(xì)剪切成糜狀，越細(xì)越好；然后用0.25%胰酶37消化20min后，用吸管輕輕吹打數(shù)次，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，離心棄上清，用含15%胎牛血清培養(yǎng)基以1×1

6、06/ml接種于塑料培養(yǎng)瓶中。     將細(xì)胞培養(yǎng)在含15%胎牛血清、100U/ml氨芐青霉素及100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37、飽和濕度、5 %CO2濃度下培養(yǎng)，23d 換液一次。實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前12 h細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)液，觀察不同濃度A25-35的作用。1.2.3  MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力  觀察不同終濃度(0、5、10、20、25、30molL)的A25-35作用24 h后，細(xì)胞活力的變化，細(xì)胞接種于96孔板24 h后加入不同濃度的A25-35作用24 h，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔L，同時(shí)設(shè)與實(shí)驗(yàn)孔平行

7、的空白對(duì)照，最后比色時(shí)以對(duì)照孔調(diào)零。共同孵育24 h后更換培養(yǎng)基，每孔加入180l的培養(yǎng)基和20l的MTT(5 mgml)，置37、5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入200l DMSO，37孵育30 min，至結(jié)晶物充分溶解。在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm的吸光度(D570)，其與對(duì)照吸光度的比值作為相對(duì)細(xì)胞活力。1.2.4  流式細(xì)胞儀檢測(cè)  將細(xì)胞接種于24孔板，待達(dá)到80融合時(shí)，按下列分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：A.對(duì)照組，B. A25-35（25mol/L），C. A25-35（25mol/L）+鹿茸多肽（400mg/ml）3，D.照射A25-35（25mol/l）+N

8、GF（20ng/ml）組。各組均6復(fù)孔。將24h以后各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 離心5min，棄上清；用500l 5mmol/L EDTA/0.01mol/L PBS洗滌細(xì)胞；再加入50l 10g/L RNaseA，室溫下孵育30min；最后加入500l 100mg/LPI染色液，旋轉(zhuǎn)混勻，置4避光孵育30min后，流式細(xì)胞儀測(cè)定。1.2.5  免疫細(xì)胞化學(xué)染色  將1cm×lcm蓋玻片經(jīng)浸酸及消毒等處理后，放入24孔培養(yǎng)板中，加入10倍稀釋的多聚賴氨酸液，置于CO2 孵箱中1h；棄去多聚賴氨酸液，用DMEM培養(yǎng)基洗一次，將各組細(xì)胞懸液

9、分別接種于各孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h；棄去原培養(yǎng)液，用37預(yù)熱的0.1mol/L PBS輕洗3次；余按免疫組織化學(xué)試劑盒說明操作。1.3  統(tǒng)計(jì)方法  應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS14.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定  單細(xì)胞懸液接種后第2d，細(xì)胞聚集成團(tuán)狀，第3d出現(xiàn)大量懸浮的neurosphere(約3060個(gè)細(xì)胞)，而且neurosphere越來越多。到第7d細(xì)胞胞體十分飽滿，輪廓清晰，有的細(xì)胞可見明顯的鳥眼狀細(xì)胞

10、核，也有的細(xì)胞伸出樹枝狀突起，突起相互連成網(wǎng)絡(luò)。用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元。鏡下觀察，可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞體飽滿，突起明顯并連成網(wǎng)狀。見圖1。圖1  烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元（略）2.2  MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力  MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的A25-35（0、5、10、20、25、30molL)作用24h后，均可引起細(xì)胞活力下降，并呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)選擇A25-35 25mol /ml劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。圖2  MTT法檢測(cè)A25-35細(xì)胞活力的影響（略）2.3  流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

11、60; 以400mg/ml劑量觀察鹿茸多肽對(duì)A25-35誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用，并用NGF作為對(duì)照。結(jié)果顯示，A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）組細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)是19.35±6.74與A組凋亡百分?jǐn)?shù)37.42±12.55比較，有顯著性差異，P<0.05，其作用與A（25molL）+NGF陽(yáng)性對(duì)照組凋亡百分?jǐn)?shù)17.88±5.91比較無(wú)差異。見圖3、表1。表1  鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用（略）圖3  鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用（略）2.4  免疫組化檢測(cè)caspase?3結(jié)果 

12、caspase?3陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)著棕色。結(jié)果顯示：對(duì)照組無(wú)caspase?3陽(yáng)性染色的細(xì)胞；A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）組caspase?3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，比單純A（25molL）組少，其作用與NGF陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)差異，鹿茸多肽對(duì)脊髓細(xì)胞凋亡具有抑制作用。見圖4。a 對(duì)照組b A組（25molL）c A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）d A（25molL）+NGF（20ng/ml）圖4  鹿茸多肽對(duì)A（25M）誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase?3的表達(dá)的影響（略）3  討論     脊髓損傷的治療是神

13、經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題，雖然人們采取了許多種方法促進(jìn)損傷后的脊髓軸突再生修復(fù)，但存在許多限制因素，很難達(dá)到理想效果，許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究脊髓神經(jīng)組織損傷后再生不良，其重要原因是傷后繼發(fā)性損害不斷加重所致，而細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵，抑制細(xì)胞凋亡是阻止或減少繼發(fā)性損傷，保護(hù)神經(jīng)功能的治療所在。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl?2（B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因家族?2）、p53等。Caspases家族對(duì)細(xì)胞，特別是神經(jīng)元凋亡程序的啟動(dòng)具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關(guān)的蛋白，又稱為死亡蛋白酶。迄今已發(fā)現(xiàn)14個(gè)家族成員，其

14、中caspase?3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路5。因此抑制caspase?3的表達(dá)是成為探索的治療途徑之一。?駁矸堊?蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)通過一定降解途徑產(chǎn)生的6，其主要的活性片段為A25-35，A25-35可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)利用輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡，觀察鹿茸多肽對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡后caspase?3表達(dá)的影響。     本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：應(yīng)用A25-35誘導(dǎo)胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡后，在細(xì)胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通過MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞

15、凋亡數(shù)目和免疫組化觀察caspase?3表達(dá)量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制A25-35誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，其作用是通過調(diào)控凋亡基因的表達(dá)，即caspase?3表達(dá)下調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)說明，鹿茸多肽主要是通過有效地降低死亡蛋白酶caspase?3的表達(dá)量，進(jìn)而抑制脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡起到保護(hù)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911?920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase?3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5（8): 943?946.3 王本祥,周秋麗.鹿茸的化學(xué)、藥理及臨床研究進(jìn)展J. 藥學(xué)學(xué)報(bào),1991, 26(9) : 714?720.4 冷向陽(yáng).鹿茸多肽對(duì)輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(3):