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文檔簡介
1、基因突變的檢測方法基因突變的檢測方法基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一,檢測方法也隨之迅速發(fā)展。 人類細(xì)胞癌基因的突變類型已如上所述,對于基因突變的檢測,1985 以前,利用 Southern 印跡法,可以篩選出基因的缺失、 插入和移碼重組等突變形式。 對于用該法法不能檢測的突變, 只能應(yīng) 用復(fù)雜費時的 DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactio n,PCR )技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展, 使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展, 目前幾乎所有的基因 突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR勺基礎(chǔ)之上,并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn),目前已達(dá)二
2、十余種, 自動化程度也愈來愈高, 分析時間大大縮短, 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很 大很提高。 其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性 ( single-strand comformational polymorphism,SSCP ) 和異源雙鏈分析法(heteroduplex analysis,HA )。下面分別介紹幾種 PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典 突變檢測方法,可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考。PCR-SSC法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上,短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象, 一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動速度改 變。其基本原理為單鏈 DNA在中性條件
3、下會形成二級結(jié)構(gòu),這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成,即使一個堿基的不同, 也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。 由于該法簡單快速, 因 而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSC法檢測小于200bp的PCR產(chǎn)物時,突變檢出率可達(dá) 70-95,片段大于 400bp 時,檢出率僅為 50左右,該法可能會存在 1的假 陽性率。應(yīng)用PCR-SSCPt應(yīng)注意電泳的最佳條件,一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影 響,同時該法不能測定突變的準(zhǔn)確位點,還需通過序列分析來確定。Sarkar 等認(rèn)為對于大于200bp的片段,用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應(yīng)用PCR-SSCP僉測點突變已見 報道于人
4、類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。 檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因, 也是檢測抑癌基因 p53 突變最常用的方法, 僅檢測 第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85%以上的p53基因突變。由于該法簡便快速,特別適合大樣本基 因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法(HA) HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈 DNA在其錯配處會形成一突起,在非變性凝膠中電泳 時,會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙 DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似,所不同的是SSCP分離的 是單鏈DNA HA法分離的是雙鏈 DNA也只適合于小片段的分
5、析。但HA對一些不能用 SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用,兩者結(jié)合使用,可使突變檢出率提高到近100%。突變體富集PCRfe( mutant-enriched PCR )本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點, 如 K-ras 基因第 12 密碼子的 BstNI 位點,第 13密古 巴子有Bgin位點。用鏈續(xù)二次的巢式 PCR來擴(kuò)增包括 K-ras第12、13密碼子的DNA片段, 在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段,野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增,而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。變性梯度凝膠電泳法(denatur
6、ing gradinent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析 PCR產(chǎn)物,如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域,檢出率可達(dá)100%,檢測片段可達(dá)1kb,最適圍為100bp-500bp。基本原理基于當(dāng)雙鏈 DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時,DNA發(fā)生部分解鏈,電泳適移率下降,當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時, 會在不同的時間發(fā)生解鏈,因影響電泳速度變化的程而被分離。 由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測, 需要一套專用的電泳裝置, 合成 的PCR引物最好在5'末端加一段40bp-50bp的GC夾,以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。
7、在DGGE勺基礎(chǔ)上,又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGEi (溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE )。DGG和 TGGE勻有商品化的電泳裝置, 該法一經(jīng)建立,操作也較簡便,適合于大樣本的檢測篩選。化學(xué)切割錯配法(chemical cleavage of mismatch,CCM ) CCM為在 Maxam-Gilbert 測序法 的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項檢測突變的技術(shù),其檢測突變的準(zhǔn)確性可與 DNA測序相仿。其基本原理為將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型 DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交,在異源雜合 的雙鏈核酸分子中
8、,錯配的C能被羥胺或哌啶切割,錯配的T能被四氧化餓切割, 經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。 該法檢出率很高, 也是檢片段最長的方法, 已有報功檢測了 1.7kb 片段,如果同時對正、反義鏈進(jìn)行分析,檢出率可達(dá)100。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度,可檢測到 10 個細(xì)胞中的 1個突變細(xì)胞。該法中的化學(xué)試劑有毒,又發(fā)展了碳二 亞胺檢測法(catodiimide,CDI ) ,CDI為無毒物質(zhì),也可檢測大片段DNA的點突變。等位基因特異性寡核苷酸分析法( allele-specific oligonucleotide,ASO ) ASO 為一種以 雜交為基礎(chǔ)對已知突變的檢測技術(shù)。以PCR和ASO
9、相結(jié)合,設(shè)計一段 20bp左右的寡核苷酸片段,其中包含了發(fā)生突變的部位,以此為探針,與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交??梢杂酶鞣N突變類型的寡核苷酸探針, 同時以野生型探針為對照, 如出現(xiàn)陽性雜交帶, 則表運河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點突變,ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。DNA芯片技術(shù)(DNA chip ) DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項 DNA分析新技術(shù),它集合 了集成電路計算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)??捎糜诨蚨?位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突
10、變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景,其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上,彼此之間重疊1個堿基,并覆蓋全部所需檢測的基因,將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交,由于至少存在1個堿基的差異,正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜,經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號,即可確定是否存在突變,該方法快速簡單、 片動化程度高, 具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ?將在基因突變檢測中心發(fā)揮非常重要的作用。連接酶鏈反應(yīng)( ligase chain reaction,LCR ) 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較,其最大特點為可 準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個基因突變,由
11、Landegree 于 1988 年首次應(yīng)用于鐮刀獎細(xì)胞貧血的 分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一 DNA鏈的5'-磷酸與另一相鄰鏈 3'-羥基連接為基礎(chǔ), 應(yīng)用兩對互補(bǔ)的引物,雙鏈 DNA經(jīng)加熱變性后,兩對引物分別與模板復(fù)性,若完全互補(bǔ),則在連接酶的作用下,使相鄰兩引物的 5'- 磷酸與 3'- 羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接,前一 次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板,如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。 LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這 32p標(biāo)記上游引物3'未端,經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加 以鑒定,其檢測敏感性達(dá)到 200個靶分子。也可設(shè)
12、計 1 個橫跨兩引物的檢測探針,用它與 LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡的方法,好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性,以及能檢測單個堿基突變的能力,因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷,并與PCR吉合用以提高其敏感性。等位基因特異性擴(kuò)增法(Allele-specific amplification,ASA ) ASA于 1989 年建立,是 PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展,也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)( amplification refractory mutation system,ARMS)、等位基因特性 PCR( all
13、ele-specificPCR,ASPCR等,用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。該法通過設(shè)計兩個5'端引物,一個與正常 DNA互補(bǔ),一個與突變 DNA互補(bǔ),對于純合性突變,分別加入這兩種引物及 3'端引物進(jìn)行兩個平行 PCR吸有與突變DNA完互 補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3'端則導(dǎo)致PCR不能延伸,則稱為ARMS ARMS ASPCR借鑒多重PCR原理,可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位 基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸,特別是當(dāng)錯配堿基為G: T時,這時可通過調(diào)整實驗條件如引物靶DN
14、A Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。 在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。 還可 通過在引物 3'端的第二個堿基引入一個錯配堿基,使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯 誤延伸。RNA酶A切割法(RNaseA cleavage)在一定條件下,氨基源雙鏈核酸分子 RNA RNA或 RNA DNA中的錯配堿基可被 RNaseA切割,切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時,RNaseA在錯配處的切割效率很低,甚至不切割,而當(dāng)錯配堿基為嘧啶時,則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈,突變檢出率只有30%,如同時分析正義和反義二條鏈,檢出率
15、可達(dá)70%。該法需要制備 RNA探針,增加了操作的復(fù)雜性,但可用于 1-2kb 的大片段進(jìn)行檢測, 并能確定突變位點。 于這些優(yōu)越性,它仍被作為一 種經(jīng)典方法用于對未知突變進(jìn)行分析。染色體原位雜交( In situ hybridization of chromosome)染色體發(fā)現(xiàn)距今已有 150多年的歷史, 染色體檢測被廣泛用于動、 植物及人類的細(xì)胞遺傳學(xué)研究, 隨著染色體分技術(shù)和分 子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。 染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大, 特別是用于腫瘤分子診斷。 腫瘤細(xì)胞的 染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象,可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面, 原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有
16、關(guān), 腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸 變,如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等;繼發(fā)性變化主要是腫瘤細(xì)胞核型 的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、 鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染 色體的檢測方法進(jìn)展很快,檢測的精確率也不斷提高,這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。熒光原位雜交技術(shù)( fluorescent in situ hybridiaation,FISH)創(chuàng)建于 1986年。 1969年Gall 和 Pardue 首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針,通過放射自顯影檢測雜交信號。應(yīng)用核 素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百 堿基的單拷貝靶核苷酸序列,敏
17、感性雖高,但定位不夠精確。FISH 具有探針穩(wěn)定、操作安全,可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優(yōu)點。FISH 的靈敏感與探針標(biāo)記方法和檢測儀器性能有關(guān),探針標(biāo)記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強(qiáng)度。FISH 探針一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法,如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記,可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用慢掃描 CCD配合影像處理理軟件,增強(qiáng)信噪比,有利于檢測微弱信號,女口 應(yīng)用TSA系統(tǒng)(tyramide signal amplification )能將雜交信號再放大 1000倍,可用于單 拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體,讓D
18、NA分子從蛋白質(zhì)中分離出來,使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上,經(jīng)引處理后,分辨率可達(dá)1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖( microdissect )法以提高分辨率。 FISH 的另一 個特點是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng),在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系,即多色FISH或多靶FISH。FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、 易位重排及缺失等的檢測, 在腫瘤診斷和鑒別診斷、 預(yù)后和治療監(jiān) 控等方面都有重要意義。Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)(oligonucleotideprimedin sit
19、u DNA synthesis,PRINS ),并成功地用于染色體特異a衛(wèi)星DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交,在DNA聚合酶作用下,當(dāng)引物延伸時,摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點。PRINS技術(shù)的優(yōu)點是不需克隆基因作探針, 且由于雜交反應(yīng)在前, 標(biāo)記在后, 故非特異懷背景低。 缺點是信號弱, 靈敏度低, 為克服這一制瞇, Terkelsen 等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)( repeated PRINS ) , 重復(fù)進(jìn) 行PRINS反應(yīng),使信號號強(qiáng)度明顯提高?;贔ISH的原理,發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記(multicolor PRINS ,可測定
20、二個以上靶序列在DNA分子上的相互的位置, 且特異性比FISH還高。DNA序列分析(DNA sequencing )應(yīng)用各種突變檢測技術(shù)檢測到的基因突變,最后都需用 序列分析才能確定突變類型及突變位置,其效率可以達(dá)到100?,F(xiàn)在的測序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同, 其基本原理雖仍是雙脫氧終止法, 但自動化程度大為提高, 操作更 簡便,測序時間也大大縮短。隨著PCR技術(shù)與測序聯(lián)合使用,不需經(jīng)過M13亞克隆步驟,故稱為直接測序法(direct sequencing,DS )。DS法測序的模板主主要來源于PCR應(yīng)用不對稱 PCR( asymmetric PCR )和基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測序法(genomic amplification withtran script seque ncin g,GAWTS)等,使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來,PCR循環(huán)測序法的建立,使模板擴(kuò)增與同步進(jìn)行, 引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記, 使每個樣品的四個測序反 應(yīng)可在一個反應(yīng)管和一個泳道內(nèi)進(jìn)行,大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自
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