棉花COL家族基因的鑒定、表達(dá)與進(jìn)化分析

1、棉花COL家族基因的鑒定、表達(dá)與進(jìn)化分析棉花是全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物之一,植物學(xué)分類屬于被子植物門(Angiospermae)、雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)、錦葵目(Malvales)、錦葵科(Malvaceae)、棉族(Gossypieae)、棉屬(Gossypium)。棉屬共50個(gè)種,包括45個(gè)二倍體及5個(gè)四倍體種。四倍體棉種包括3個(gè)野生棉,即毛棉、黃褐棉及達(dá)爾文氏棉,此外陸地棉和海島棉是目前世界上栽培面積最廣的兩個(gè)栽培種。栽培種由野生種馴化而成,由于長(zhǎng)期栽培、馴化及選擇作用,野生棉伴隨著對(duì)光周期敏感的多年生短日照生長(zhǎng)習(xí)性轉(zhuǎn)變?yōu)楣庵芷诓幻舾械囊荒晟L(zhǎng)習(xí)性。發(fā)掘棉花光周期相關(guān)

2、基因,研究光周期開花途徑的作用機(jī)制,對(duì)于棉花適應(yīng)多樣性的環(huán)境及種植面積的擴(kuò)展十分有益。CO(CONSTAN)COL(CONSTANS-LIKE)基因是調(diào)控植物光周期開花的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。CCS上游生物鐘相關(guān)基因(GIGANTEA)G的影響，并激活下游的成花素FT(FLOWERINGLOCUST濱達(dá).對(duì)于特定基因或位點(diǎn)的選擇作用，會(huì)導(dǎo)致栽培種群體內(nèi)核酸多樣性水平降低、基因頻率的降低或升高而偏離中性期望及連鎖不平衡的增加。目前水稻中已經(jīng)證明COL因是選擇的靶標(biāo)基因。鑒于CO瑤族基因在光周期開花途徑中的保守功能，棉花中CO瑤族基因信息的局限性以及馴化選擇中作用未知。本研究根據(jù)擬南芥、水稻的COLB

3、族基因信息從全基因組水平分離棉花的CO瑤族基因，對(duì)其進(jìn)行分類、結(jié)構(gòu)特征、定位、組織表達(dá)、晝夜節(jié)律表達(dá)及分子進(jìn)化等系統(tǒng)分析,主要研究結(jié)果如下:1.利用比較基因組學(xué)，根據(jù)擬南芥、水稻的COL家族基因信息，比較雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定了23個(gè)棉花COLa族基因根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，該家族基因分為3類，其中I類基因包括COL1-8,均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。AA分析顯示有2個(gè)B-box及1個(gè)CC琢才域（COL8除外）；II類基因包括COL9-11，也包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，有1個(gè)B-box及1個(gè)CCT域；m類基因包括COL12-23，該類基因包含一個(gè)完整的B-box,一個(gè)分化的鋅指結(jié)構(gòu)及一個(gè)CC錨構(gòu)

4、域。該類基因結(jié)構(gòu)比較多變,包括2個(gè)或3個(gè)內(nèi)含子。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了20個(gè)COLa族基因在棉花TM-1根、莖、葉、花藥、花瓣等不同組織及0DPA10DPAR20DPA千維發(fā)育不同階段的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，I類中的八個(gè)基因中，COL1-5,COL8等六個(gè)基因在葉中高表達(dá),COL6和COL7t花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。此外，COL2-5在纖維中表達(dá)也較高。II類中三個(gè)基因均在葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。田類中九個(gè)基因，除COL14COL2吸COL2汾別在莖、葉及纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)外，其余六個(gè)基因均是組成型表達(dá)。3 .在LD或SD條件下,分別處理陸地棉TM-1及海島棉H7124，連續(xù)48h取三葉一心期葉片進(jìn)行C

5、O瑤族基因表達(dá)特征分析。結(jié)果顯示已分析的20個(gè)基因中有18個(gè)基因的表達(dá)表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性，表明棉花COIB族基因參與棉花光周期調(diào)控的開花途徑,在棉花的光周期開花途徑中起重要作用。4 .選擇包括野生棉、陸地棉及海島棉等25個(gè)棉材料及外類群長(zhǎng)梗肖槿為研究材料，對(duì)CO/Hd1所在的I類中8個(gè)基因進(jìn)行分子進(jìn)化相關(guān)分析。通過各基因基因組與cDNA行多序歹I比對(duì)分析，結(jié)果表明這8個(gè)COLS因非常保守，均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。8個(gè)COL!因其DN瞼長(zhǎng)變異范圍為1,030bp-1,611bp,內(nèi)含子長(zhǎng)度的變異范圍為77bp-680bp。通過比較不同棉種間同一亞組其同源基因的變異發(fā)現(xiàn),COL2,COL6及C

6、OL8ft供試材料間的內(nèi)含子或外顯子H區(qū)發(fā)生插入/缺失,導(dǎo)致長(zhǎng)度變異。而同一材料其A-及D亞組部分同源基因的結(jié)構(gòu)變異表明，COL4和COL琳外顯子I或外顯子H發(fā)生插入/缺失，導(dǎo)致At及Dt間長(zhǎng)度變異。5.系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,A組供體阿非利加棉與異源四倍體棉A亞組聚在一起,D組供體與異源四倍體棉D(zhuǎn)亞組聚為一類。184個(gè)成對(duì)比較中,其Avs.D、Atvs.Dt成對(duì)比較的進(jìn)化速率高于Avs.At及Dvs.Dt進(jìn)化速率占到98.37%。進(jìn)一步分析證明Avs.D與Atvs.Dt進(jìn)化速率之間表現(xiàn)極高的正相關(guān),最小的相關(guān)系數(shù)r值為0.797。說明異源四倍體中,8個(gè)COLB族基因的A-及D-亞組間是獨(dú)立進(jìn)化的。

7、6.通過成對(duì)比較8個(gè)COLa族基因組合，以及每個(gè)基因在所有四倍體棉種及AD基因組間的核酸多樣性(冗)。結(jié)果表明8個(gè)基因組合中,DvsDt核酸多樣性(0.01051),顯著大于AvsAt的核酸多樣性(0.00586)(P=4.9E-21)。單個(gè)基因分析表明，COL2-COL5,COL及COL8a6個(gè)基因在Dt中的進(jìn)化速率顯著快于At,COL6是在At的進(jìn)化速率顯著快于Dt,而COL仰因的進(jìn)化速率在At和Dt之間無(wú)顯著差異。綜上所述,8個(gè)COLB族基因在At及Dt間的進(jìn)化速率不同，大部分基因其Dt的進(jìn)化速率快于Ato7.分別分析野生棉、陸地棉及海島棉的8個(gè)COL1因位點(diǎn)其核酸多樣性冗total,結(jié)

8、果顯示野生棉的冗total,顯著高于陸地棉(0.00369vs0.00139)(P=0.001)及海島棉(0.00369vs0.00035)(P=7.3E-7),表明陸地棉及海島棉在馴化過程中存在瓶頸效應(yīng)。進(jìn)一步比較B-box,Var及CCT&三個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同棉種中的核酸多樣性，發(fā)現(xiàn)B-box(0.00284vs0.00119,P=0.028)及Var(0.00243vs0.00119,P=0.014)結(jié)構(gòu)域的核酸多樣性顯著高于CCTM才域,B-box及Var結(jié)構(gòu)域間的核酸多樣性無(wú)顯著差異。說明B-box及Var結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中發(fā)生較大變異,而CC錨構(gòu)域在不同棉種間高度保守,功能上也比較保守。8.通過對(duì)8個(gè)CO瑤族基因進(jìn)行TajimasD,FuandLisD和F中性檢驗(yàn),表明陸地棉在COL1MCOL型存在大量的低頻率位點(diǎn)，這與陸地棉最近發(fā)生的正選擇作用