人源抗丙型肝炎病毒噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選

1、    人源抗丙型肝炎病毒噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選        摘要：目的構(gòu)建人丙型肝炎病毒(HCV)特異性噬菌體抗體庫，制備人源抗HCV單克隆抗體(mAb)。方法用常規(guī)RT?PCR法，直接從5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴細(xì)胞中，擴(kuò)增抗體重鏈Fd基因和輕鏈基因，與噬菌體載體pComb3連接，構(gòu)建噬菌體抗體Fab庫。對抗體庫進(jìn)行5輪吸附洗脫擴(kuò)增的親和選擇后，以ELISA法鑒定抗HCV噬菌體抗體。結(jié)果RT?PCR可有效地?cái)U(kuò)增出Fd和基因，并以此構(gòu)建成容量為1.2×10

2、7的噬菌體抗體庫。經(jīng)5輪親和選擇可使特異性噬菌體抗體得到高度富集，抗HCV噬菌體抗體陽性克隆達(dá)96。結(jié)論抗HCV噬菌體抗體庫的構(gòu)建和人源抗HCVmAb的制備，為HCV感染的診斷、治療和發(fā)病機(jī)制的研究提供有效的分子工具。關(guān)鍵詞：噬菌體抗體庫； HCV； 人源單克隆抗體中號：Q782文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-8738(2000)03-0189-04Construction and screening of human hepatitis C virus-specific phage antibody combinatorial library ZHANG Jian-qiongZHANG X

3、ue-pingXIE WeiLIN LingSHAN Xiang-nian（Department of Microbiology Immunology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China）WANG Yan（Navy General Hospital Beijing, China）Abstract: Aim Human monoclonal antibodies to hepatitis C virus NS4 mosaic antigen were generated from ph

4、age antibody combinatorial library. Methods Employing routine RT-PCR, the human Fd and light chains genes were amplified in human peripheral blood lymphocytes from patients infected with HCV by sets of oligonucleotide primers. Phage antibody library was constructed with the Fd and chain genes using

5、pComb3 as vector. The affinity selection and ELISA were adopted for identification of specific phage antibodies to HCV. Results HCV-specific phage antibody library was constructed using Fd and genes and pComb3 vector. The library size was about 1.2× 107. The HCV-specific phage antibodies were h

6、ighly enriched after five rounds of biopanning against HCV NS4 mosaic antigen and positive clones were detected upto 96 by ELISA. Conclusion HCV-specific antibody library and human monoclonal antibodies to HCV can be very useful as molecular tools for research diagnosis and therapy of HCV infection.

7、 Keywords: phage antibody library; HCV; human monoclonal antibody 丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后肝炎和散發(fā)性非甲非乙型肝炎的主要病因，至少有50的HCV感染者發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HCV是單鏈正股RNA病毒，基因組約為9.5kb。HCV基因組有高度的變異性，目前HCV已分為11個(gè)基因型和70余個(gè)亞型1。由于HCV基因序列的高度異質(zhì)性，使HCV的血清學(xué)檢測和疫苗的研制面臨重重困難，在被動免疫中應(yīng)用中和抗體可能性也受到阻礙2。Farci等4的實(shí)驗(yàn)表明，在HCV慢性感染者體內(nèi)有特異性中和抗體。病毒的包膜蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的攻

8、擊目標(biāo)，抗HCVE2包膜蛋白超變區(qū)(HVR1)的特異性抗體，能封閉HCV吸附培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞3，并能與兩株不同基因型的HCV發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，制備人源性抗HCV抗體，對于HCV的診斷、治療、制備疫苗及發(fā)病機(jī)制的研究等均有一定的價(jià)值。噬菌體抗體庫技術(shù)為人源mAb的制備提供了有效的手段5。我們用常規(guī)RT-PCR技術(shù)，從丙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因，構(gòu)建人源性噬菌體抗體庫，并從中篩選到多株抗HCVNS4多基因型嵌合抗原的噬菌體抗體。1材料和方法1.1材料噬菌粒pComb3購于美國Scripps研究所。輔助噬菌體VCSM13和HRP-羊抗M13抗體為Pharmacia公司產(chǎn)品。M-ML

9、V，Trizolreagent為ISSN1007-8738細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(JCellMolImmunol)2000;16(3)Gibco公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均為Promega公司產(chǎn)品。其它有關(guān)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。HCVNS4多基因型嵌合蛋白，由美國CDC孟繼鴻教授惠贈。SB，SOC和LB培養(yǎng)液按常規(guī)方法自配。1.2方法1.2.1人外周血淋巴細(xì)胞的分離從本院附屬醫(yī)院門診隨機(jī)取5例經(jīng)第2代ELISA試劑檢測血清抗HCVIG強(qiáng)陽性，PCR檢測HCVRNA陽性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴細(xì)胞分層液按常規(guī)方法制備人外周血淋巴細(xì)胞，并用冷PBS洗3次，

10、混合后用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)，分裝(每管5×106細(xì)胞)。5例患者經(jīng)HCV5端非編碼區(qū)型特異性引物PCR分型，4例為1b型，1例為3型。1.2.2總RNA提取和cDNA第1鏈的合成以Trizolreagent提取細(xì)胞總RNA，按說明書操作。取RNA2L測A260nm和A280nm值鑒定其濃度和純度。另取5LRNA，用6g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性。取10gRNA溶液，加入Olig。(dT)4L(0.4g)，于70變性8min，冰浴5min。分別加入5×Buffer10L，2.5mmol/LdNTP10L，0.1mol/LDTT5L，RNA酶抑制物40U和M-MLV40

11、0U，用DEPC處理水補(bǔ)足體積至50L，37水浴1h，955min，冰浴10min，于-20儲存。1.2.3引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增Fd和基因PCR所用人抗體引物，根據(jù)Kang6的設(shè)計(jì)加適當(dāng)改動和簡并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE純化。IgG1CH3端引物為：5-GCATGTACTAGTTTTGTC-ACAAGATTTGGG；VH5端引物P1為：5-SAGG-TGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由VH1a與VH3a簡并與)；P2為：5-SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG(由VHlf與VH3f簡并)；P3為：5-CAGGTGCAGC-TRCTCGAGTCGGG(由VH與VH4f簡并

12、)。C3端引物為：5-GCGCCGTCTAGAACTAAC-ACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；V5端引物為：5-GAMATYGAGCTCACSCAGTC-TCCA(由V1a與V3a簡并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重鏈引物中分別含有內(nèi)切酶XhoI和SpeI的識別序列(下畫線部分)；輕鏈引物中分別含有內(nèi)切酶SacI和XbaI的識別序列(下畫線部分)。每管以5LcDNA為PCR反應(yīng)的模板，分別對Fd和基因進(jìn)行擴(kuò)增。1.2.4大腸桿菌的電穿孔轉(zhuǎn)化將2.5mL過夜培養(yǎng)的XL1-Blue菌液，接種在400mL含有四環(huán)素10mg/L的SB中，37培養(yǎng)至A6

13、00nm值為0.5。置冰浴中15min，于4離心棄上清，用100mL/L冷甘油水將細(xì)菌洗滌3次后，懸于4mL100mL/L甘油中即為感受態(tài)細(xì)胞。分裝(每管0.2mL)，于液氮中凍5min后，取出，置-70凍存。按Bio-Rad基因脈沖儀說明書中所述方法進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化。1.2.5噬菌體抗體庫的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，以QIAGEN凝膠提取Kit純化，SacIXbaI雙酶切，再以PCR產(chǎn)物純化Kit純化。然后用T4DNA連接酶使之與相應(yīng)酶切純化的噬菌粒pComb3連接，電穿孔轉(zhuǎn)化XL1-Blue細(xì)胞，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌。擴(kuò)增后提取質(zhì)粒得到含輕鏈片段的pComb3。對其進(jìn)行XhoISpe

14、I雙酶切，并與用相應(yīng)酶切的重鏈FdPCR產(chǎn)物連接，電穿孔轉(zhuǎn)化XL1-Blue。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌加2mL預(yù)熱的SOC，置37振蕩培養(yǎng)1h后，轉(zhuǎn)移至SOC固體平板(含氨芐青霉素100mg/L，四環(huán)素10mg/L)，于37培養(yǎng)24h。用SB洗下菌苔，取20L菌液加入20mL含氨芐青霉素的SB中，37培養(yǎng)至A600nm約為0.5。加入約1011pfu的輔助噬菌體VCSM13，37培養(yǎng)1h，再加入終濃度為70mg/L的卡那霉素，振蕩培養(yǎng)過夜。離心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴1h后，于4以12000r/min離心。棄上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/m

15、in離心5min，棄去不溶物，收集上清即為噬菌體抗體庫。1.2.6噬菌體抗體庫的篩選將HCVNS4嵌合蛋白以每孔100ng包被ELISA板條，用30g/LBSA封閉、PBS洗后，加入噬菌體抗體庫100L(約1012cfu)，37溫育2h。吸出噬菌體抗體液，以PBST洗1次(第2輪洗5次，第3，4，5輪各洗10次)，PBS洗1次，加入100L洗脫液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸調(diào)至pH2.2，并含1g/LBSA)于室溫靜置10min。將洗脫液稍加吹打后吸出，立即用6L2mol/LTris中和，并加入2mLXL1-Blue，于37靜置20min后，再加入20mLSB(含氨芐青霉素和四環(huán)素)，取

16、10L稀釋鋪盤測定cfu。其余細(xì)菌置37培養(yǎng)2h后，加入VCSM13和卡那霉素。噬菌體的沉淀和收集均按步驟1.2.5中的程序進(jìn)行。反復(fù)進(jìn)行“吸附洗脫擴(kuò)增”5次淘洗，以使特異性噬菌體抗體高度富集。1.2.7單克隆噬菌體抗體的制備及鑒定將經(jīng)第5輪篩選、洗脫的噬菌體感染XL1-Blue后劃平板，過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑選細(xì)菌菌落，接種于4mL含氨芐青霉素和四環(huán)素的SB中，置37振蕩培養(yǎng)過夜。取200L加到4mL含同樣量抗菌素的SB中，再37振蕩培養(yǎng)2h，加入40L的VCSM13培養(yǎng)2h后，加卡那霉素至70mg/L，置30振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集上清，即為單克隆噬菌體抗體，置4保存。將待檢噬菌體抗體與等量10g

17、/LBSA混合后，置室溫孵育20min，加到已經(jīng)HCVNS4嵌合蛋白包被和BSA封閉的ELISA板中，于37溫育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以TMB顯色。實(shí)驗(yàn)中采用VCSM13作為陰性對照。2結(jié)果2.1細(xì)胞總RNA的提取采用Trizolreagent提取RNA法，每5×106個(gè)淋巴細(xì)胞可得到610gRNA(A260nm/A280nm=1.51.8)?？俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見28sRNA，18sRNA及5sRNA3條帶，其中28sRNA與18sRNA帶之間有類似Smear現(xiàn)象，為不同分子量的mRNA(1)。1人外周血淋巴細(xì)胞

18、總RNA的分離Fig1IsolationoftotalRNAfromhumanperipheralbloodlymphocytes1:TotalRNA;2:TotalRNA.2.2Fd基因和輕鏈基因的擴(kuò)增用Kang設(shè)計(jì)的3端及簡并后的P1,P2和P33條5端重鏈引物，鏈3端及簡并的5端引物配對后，對5例HC患者混合外周血淋巴細(xì)胞的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，均可見濃的特異性擴(kuò)增帶。與分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較，其DNA片斷的大小約為700bp，與推測的抗體重鏈Fd及輕鏈基因的大小相同6(2)。2RT-PCR擴(kuò)增人IgFd和輕鏈基因Fig2AmplificationofhumanIgFdandgenesbyRT-P

19、CR1:X174/HaeIIImarker;2:PCRproductofFdgene(5terminalprimerP1);3:PCRproductofFdgene(5terminalprimerP2);4:PCRproductofFdgene(5terminalprimerP3);5:PCRproductofgene.2.3噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選分別將不同引物擴(kuò)增的Fd和鏈基因的PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成噬菌體抗體庫，測定庫的容量為1.2×107。隨機(jī)挑取10個(gè)菌落擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，用XbaIXhoI雙酶切檢測，5個(gè)克隆切出約2.4kb的帶(3中的第2，4，7

20、，10和11道)，即同時(shí)含有Fd段基因和鏈基因；4個(gè)克隆切出約1.7kb的片段(第1，3，5和9道)，即僅含有Fd或鏈基因，1個(gè)克隆為變異株(第8道)，說明Fab重組率為50。以固相化的HCVNS4抗原對噬菌體抗體庫進(jìn)行5輪“吸附洗脫擴(kuò)增”的淘篩，盡管淘洗強(qiáng)度逐輪加大，但洗脫下來的噬菌體滴度明顯增加，說明攜帶有抗HCVNS4的特異性抗體的噬菌體得到了高度富集(表1)。3噬菌體抗體庫的限制內(nèi)切酶鑒定Fig3Restrictionenzymeanalysisofphageantibodylibrary1，3，5and9:ContainFdorclones;6：DNAmolecularmarker(

21、kb);2,4,7,10and11:ContainFabclones.Threearrowsinthefigureseparatelyindicade3.0,2.4and1.7kbfromtoptobottom.2.4噬菌體抗體的鑒定從第5輪篩選后得到的菌落中，隨機(jī)挑選30個(gè)克隆制備噬菌體抗體，用ELISA測定其抗原結(jié)合活性，有29個(gè)克隆對HCVNS4嵌合抗原呈陽性反應(yīng)，而與BSA和HBsAg均不發(fā)生交叉反應(yīng)。表1親和選擇對噬菌體抗體的富集效應(yīng)Tab1SelectiveenrichmentofphageantibodiesfromlibrarybyHCVNS4biopanningRoundso

22、fClonescontainingcfu added cfuelutedpanningFabgenes11×1012-21×10121.0×106-31×10123.0×1058/1041×10126.7×10510/1051×10123.0×10610/103討論mAb已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和基礎(chǔ)研究中，并取得了令人矚目的成果。但鼠源性mAb易引起人體產(chǎn)生抗鼠抗體，制約了mAb在體內(nèi)的應(yīng)用。噬菌體抗體庫技術(shù)，可在短期內(nèi)制備人源mAb，使之體內(nèi)應(yīng)用展示了良好的前景。我們采用RT-PCR法，成功地?cái)U(kuò)增出丙型肝

23、炎患者外周血淋巴細(xì)胞中的重鏈Fd基因和輕鏈基因。擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。經(jīng)自然免疫的人體(如患者或感染者)是目的抗體基因的良好來源。自然免疫的人體內(nèi)目的抗體基因的mRNA豐度相對較高，有利于所建文庫的篩選，并利于克隆出高親和力的抗體。因此，我們選擇抗HCVIgG陽性、國內(nèi)流行的優(yōu)勢基因型HCV感染者作為采血對象，采血3050mL即可滿足建庫所需。關(guān)于細(xì)胞總RNA的提取，多種方法均強(qiáng)調(diào)RNA的純度，即A260nm/A280nm值應(yīng)達(dá)1.82.0，使眾多研究者花費(fèi)了大量時(shí)間及經(jīng)費(fèi)，一味增加提取步驟，反復(fù)沉淀純化。我們的研究表明，提取步驟應(yīng)盡量簡化，以減少污染RNA酶降解RNA的機(jī)會。對于

24、RT-PCR，RNA的純度固然重要，但RNA的完整性更為重要。因此，可用瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性。但是，由于DNA與RNA的電泳遷移速率互不相同(RNA比等長的DNA遷移得快)，故不能用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物對RNA的分子進(jìn)行測定。檢查總RNA的完整性，只需看到RNA的3條帶，即可證實(shí)提取成功，不需要測定其分子量。我們曾用兩種方法，多次提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA，A260nm/A280nm值=1.11.8不等，用不同比值的RNA進(jìn)行RT-PCR，均可獲得滿意結(jié)果。采用多例攜帶不同基因型HCV感染患者的外周血淋巴細(xì)胞，進(jìn)行混合分裝，并使每個(gè)分裝(5×106細(xì)胞)代表一定的人群

25、范圍，以便于每次基因擴(kuò)增能獲得較好的效果。經(jīng)過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，可使抗體庫容量達(dá)1.2×107，F(xiàn)ab基因的重組率達(dá)50。為了篩選抗HCV特異性噬菌體抗體，經(jīng)嚴(yán)格的5輪親和淘篩，可使特異性噬菌體抗體高度富集。在第5輪篩選后，挑選30個(gè)克隆用ELISA進(jìn)行特異性檢測，證明有29個(gè)克隆可與HCVNS4抗原特異性結(jié)合，陽性克隆率為96。國內(nèi)外報(bào)道，篩選抗體庫均為34輪，我們在篩選過程中發(fā)現(xiàn)，洗滌次數(shù)應(yīng)達(dá)10次，才能使陰性對照孔中的VCSM13完全洗去。因此，第1，2輪篩選分別洗滌1次和5次，洗脫出的噬菌體中含有較多的非特異性噬菌體和輔助噬菌體，產(chǎn)出率也較高，但不能代表特異性噬菌體富集。我們也嘗

26、試在第1輪篩選時(shí)，即洗滌10次，經(jīng)3輪篩選后，未得到特異性噬菌體抗體，可能是第1輪的強(qiáng)洗滌將極少量的特異性克隆洗去所致，而改用5輪篩洗法后，才獲得理想的結(jié)果。 基金項(xiàng)目：江蘇省科技發(fā)展基金資助，No. BJ97070作者簡介：張建瓊，女，38歲，博士。南京市丁家橋路87號，Tel. (025)3324421 ? 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit 張建瓊（南京鐵道醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇南京 210009）張雪萍（南京鐵道醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇南京 21000

27、9）謝維（南京鐵道醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇南京 210009）林陵（南京鐵道醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇南京 210009）單祥年（南京鐵道醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇南京 210009）王琰（北京海軍總醫(yī)院）參 考 文 獻(xiàn) : 1 Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, et al. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 regionJ . J Gen Vir