RAPD和SRAP標(biāo)記技術(shù)在苔蘚植物親緣關(guān)系研究中的比較分析

1、基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目“太行山苔蘚植物資源調(diào)查及新型生物工程載體開發(fā)”(0624240019;河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目“河南省苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究”(2008C180002。第一作者簡(jiǎn)介:張安世,男,1965年出生,副教授,碩士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。通信地址:454003河南省焦作市山陽(yáng)路998號(hào)焦作師范高等?？茖W(xué)校生物系,Tel :0391-*,E-mail:aszhang1212 。收稿日期:2009-11-20,修回日期:2009-12-09。0引言苔蘚植物是以孢子繁殖,由水生向陸生過(guò)渡的一個(gè)植物類群,在植物界的系統(tǒng)演化中占據(jù)著特殊地位。全世界的苔蘚植物約有230

2、00種,在高等植物中其種類僅次于被子植物,中國(guó)約有2709種,是世界上苔蘚植物多樣性最豐富的國(guó)家之一1。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)發(fā)展,特別是分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用2-6,為探討苔蘚植物的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)演化和分類位置提供了依據(jù)。目前,常用的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)主要有RAPD 、SSR 、AFLP 和SRAP 等,且在種植資源鑒定、遺傳多樣性分析等方面都有較廣泛的應(yīng)用。每種分子標(biāo)記技術(shù)都有其獨(dú)特性和局限性。由于RAPD 技術(shù)具有價(jià)格低廉、簡(jiǎn)便快捷、對(duì)模板DNA 需要量極少、對(duì)DNA 要求RAPD 和SRAP 標(biāo)記技術(shù)在苔蘚植物親緣關(guān)系研究中的比較分析張安世,張為民,邢智峰,劉永英,韋慧彥,辛澤

3、華(焦作師范高等專科學(xué)校生物系,河南焦作454003摘要:利用RAPD 和SRAP 標(biāo)記技術(shù)研究11種苔蘚植物的親緣關(guān)系,并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:RAPD 擴(kuò)增的多態(tài)性比率達(dá)100%,SRAP 擴(kuò)增的多態(tài)性比率達(dá)96.9%,2種標(biāo)記結(jié)果均顯示了很高的多態(tài)性比率。利用SPSS11.5軟件對(duì)RAPD 和SRAP 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了聚類分析,兩者均與形態(tài)學(xué)分類基本一致,但與形態(tài)學(xué)結(jié)果也有一定的差異,這種差異主要表現(xiàn)在科以上植物種類之間。同時(shí),2種分子標(biāo)記的聚類結(jié)果之間也存在一定的差異,主要是對(duì)大葉鳳尾蘚和小牛舌蘚全緣亞種的劃分。因此,RAPD 和SRAP 都有一定局限性,需要多種標(biāo)記方法相互結(jié)合、相互

4、印證,才能得出客觀的結(jié)果。關(guān)鍵詞:苔蘚;RAPD ;親緣關(guān)系;遺傳多樣性中圖分類號(hào):Q781文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 論文編號(hào):2009-2441The Comparative Analysis on the Study of Genetic Relationship ofBryophytes Based on RAPD and SRAP MarkersZhang Anshi,Zhang Weimin,Xing Zhifeng,Liu Yongying,Wei Huiyan,Xin Zehua(Department of Biology,Jiaozuo Teachers College,Jiaozuo

5、Henan 454003Abstract:RAPD and SRAP markers were applied to assess genetic relationship in 11individuals of bryophytes.Theresults showedthatboth oftechniquesdetected high proportion of polymorphic bands,which were 100%from RAPD and 96.9%from SRAP.By means of cluster analysis using SPSS11.5software ,t

6、heresultant dendrograms from RAPD and SRAP analyses were showed the generally correspondence with morphological classification except for some species among family.Comparing the two techniques,there were also somedifferencesbetweenSRAP and RAPDmarkers,mainlyin the classificationofFissidensgrandifron

7、sBrid.and Anomodon minor (Hedw.Fegerrimus (Mitt.Iwats.Therefore,RAPD and SRAP hadcertain limitations,and two molecular techniques should be combined in practice in order to obtain objective results.Key words:bryophytes;RAPD;genetic relationship;genetic diversity中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2010,26(3:32-36Chin

8、ese Agricultural Science Bulletin不高等優(yōu)點(diǎn)而成為研究生物多樣性和親緣關(guān)系的重要方法之一。SRAP 是近幾年開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù),具有RAPD 的操作簡(jiǎn)便性,與SSR 相比,省去了開發(fā)引物的困難,同時(shí)又避免了AFLP 的酶切、連接和擴(kuò)增雜交等繁瑣步驟,因此,SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)具有以往的一些分子標(biāo)記技術(shù)不可比擬的優(yōu)越性7-9,它一經(jīng)問(wèn)世便受到大多數(shù)分子生物學(xué)家的青睞。該研究利用RAPD 和SRAP 兩種分子標(biāo)記方法對(duì)11種苔蘚植物進(jìn)行遺傳多樣性分析,旨在為苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究和分子標(biāo)記圖譜構(gòu)建提供分子生物學(xué)依據(jù),同時(shí)對(duì)兩者的結(jié)果進(jìn)行比較分析,探討兩者在

9、研究苔蘚植物遺傳多樣性上的可行性。1材料與方法1.1材料此實(shí)驗(yàn)所用苔蘚均采自河南省云臺(tái)山世界地質(zhì)公園(表1。選取幼嫩莖葉,用塑料袋封裝,然后裝入冰盒保鮮,帶回實(shí)驗(yàn)室后分別用自來(lái)水、超純水漂洗2次除去塵渣等雜物,用吸水紙吸干后保存于-80冰箱備用。表1苔蘚植物種類名稱編號(hào)1234567891011種名鱗葉蘚Taxiphyllum taxirameum (Mitt.Fleish.金灰蘚Pylaisiella polyantha (Hedw.Grout 黃灰蘚Hypnum pallescens (Hedw.P.Beauv.灰蘚凹葉變種Hypnum cupressiforme Hedw.Var.Lac

10、unosum Brid 大葉鳳尾蘚Fissidens grandifrons Brid.多枝青蘚Brachythecium fasciculirameum C.Muell.彎葉青蘚Brachythecium reflexum (Stark.B.S.G 牛角蘚Cratoneuron filicinum (Hedw.Spruce 小牛舌蘚全緣亞種Anomodon minor (Hedw.Fegerrimus (Mitt.Iwats.擬溪邊扭口蘚Barbula subrivicola Chen 卷葉毛口蘚Trichostomum involutum Broth.科名灰蘚科H

11、ypnaceae灰蘚科Hypnaceae灰蘚科Hypnaceae灰蘚科Hypnaceae鳳尾蘚科Fissidentaceae 青蘚科Brachytheciaceae 青蘚科Brachytheciaceae 柳葉蘚科Amblystegiaceae 牛舌蘚科Anomodontaceae 叢蘚科Pottiaceae叢蘚科Pottiaceae1.2試劑和儀器1.2.1試劑Taq DNA 聚合酶、dNTP 和SRAP 引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;RAPD 引物購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;無(wú)CTAB 緩沖液:200mmol/LTris-HCl(pH8.0,50mmol/LEDTA(pH8

12、.0,250mmol/L NaCl,2%PVP ;2CTAB :2%CTAB ,100mmol/L Tris-HCl(pH8.0,1.4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA (pH8.01.2.2儀器5804R 型冷凍離心機(jī)(Eppdoff ,UV-1700(日本島津紫外分光光度計(jì),PTC-200PCR 儀,ChampGel-3220凝膠成像系統(tǒng)。1.3總DNA 的提取參考文獻(xiàn)10。1.4擴(kuò)增條件RAPD 擴(kuò)增條件:Taq 酶,1.0U ;Mg 2+濃度,2.0mmol/L ;dNTP 濃度,0.2mmol/L ;模板DNA60ng ;引物濃度,10pmol 。反應(yīng)體積為25L 。

13、RAPD 擴(kuò)增程序?yàn)?94預(yù)變性3min ;94變性1min ,36復(fù)性1min ,72延伸2min ,循環(huán)43次;72延伸10min ;4保存。SRAP 擴(kuò)增條件:Mg 2+:2.5mmol/L ;dNTP :0.3mmol/L ;引物:15pmol ;Taq :1.5U 。SRAP 擴(kuò)增程序?yàn)?94預(yù)變性5min ;94變性1min ,33復(fù)性1min ,72延伸1.5min ,循環(huán)5次;94變性1min ,53復(fù)性1min ,72延伸1.5min ,循環(huán)35次;72延伸7min ;4保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5g/mL 溴化乙錠、1TBE 緩沖液、3V/cm 電場(chǎng)中電泳分

14、離,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。1.5引物選擇選取北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成的RAPD引物B 組和C 組引物共40個(gè);選取上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的SRAP 引物,其中正向引物為Me1,Me2,Me3,Me4,Me5,Me6,反向引物為em7,em8,em9,em10,em11。正向、反向引物兩兩組合,選取其中30個(gè)引物組合。以11種苔蘚植物為材料進(jìn)行RAPD 和SRAP 擴(kuò)增,從中選取多態(tài)性高、重復(fù)性好且DNA 條帶清晰的引物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及聚類分析根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果,統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù),在同一位置上出現(xiàn)的條帶計(jì)為1,無(wú)則計(jì)為0,構(gòu)建(0,1矩陣,計(jì)算擴(kuò)

15、增產(chǎn)物的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶及多態(tài)性比率。應(yīng)用SPSS11.5分析軟件,按Average Linkage 法進(jìn)行聚類分析,建立聚類樹狀圖。張安世等:RAPD 和SRAP 標(biāo)記技術(shù)在苔蘚植物親緣關(guān)系研究中的比較分析 33 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2結(jié)果與分析2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比較分析利用11個(gè)苔蘚植物的DNA 模板分別對(duì)所供的RAPD 引物和SRAP 引物進(jìn)行篩選,共選出B 8、B 10、B 20、C 4、C 6和C 15等6個(gè)RAPD 引物和Me5/em7、Me5/em8、Me6/em11、Me5/em9、Me2/em10等5個(gè)SRAP 引物組合。各引物序列見表2。利用篩選出的RAPD 和SRAP 引

16、物對(duì)11種苔蘚植物進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增。結(jié)果表明,6個(gè)RAPD 引物共擴(kuò)增出77條帶,平均每個(gè)引物擴(kuò)增12.8條帶,5個(gè)SRAP 引物組合共擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為71條,平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增14.2條帶。研究結(jié)果還顯示,6個(gè)RAPD 引物所擴(kuò)增的77個(gè)條帶均為多態(tài)性條帶,多態(tài)性比率高達(dá)100%。在5個(gè)SRAP 引物組合所擴(kuò)增的71個(gè)條帶中,共占據(jù)65個(gè)位點(diǎn),多態(tài)性條帶63條,多態(tài)性比率為96.9%。因此兩種標(biāo)記的結(jié)果均顯示了很高的多態(tài)性比率,說(shuō)明11種苔蘚植物遺傳性差異較大,基因型間具有高度的遺傳多態(tài)性。但就每個(gè)引物平均擴(kuò)增的條帶數(shù)而言,SRAP 擴(kuò)增更多。圖1和圖2顯示RAPD 引物B 20和SRAP

17、引物Me6/em11對(duì)11種苔蘚植物的擴(kuò)增結(jié)果。2.2遺傳多樣性和聚類結(jié)果的比較分析將SRAP 和RAPD 引物擴(kuò)增后得到的二元數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析,對(duì)供試材料根據(jù)歐氏遺傳距離,按Average Linkage 法進(jìn)行聚類分析,建立聚類樹表2RAPD 和SRAP 引物 RAPD 引物B 8B 10B 20C 4C 6C 15序列(53GTCCACACGG CTGCTGGGAC GGACCCTTAC CCGCATCTAC GAACGGACTC GACGGATCAGSRAP 引物Me5/em7Me5/em8Me6/em11Me5/em9Me2/em10序列(53Me5:TGAGTC

18、CAAACCGGAAG;em7:GACTGCGTACGAATTGAGMe5:TGAGTCCAAACCGGAAG;em8:GACTGCGTACGAATTGCCMe6:TGAGTCCAAACCGGTAA;em11:GACTGCGTACGAATTCCAMe5:TGAGTCCAAACCGGAAG;em9:GACTGCGTACGAATTCGAMe2:TGAGTCCAAACCGGAGC;em10:GACTGCGTACGAATTCAG 圖1引物B 8對(duì)11種苔蘚植物的RAPD 擴(kuò)增結(jié)果 圖2引物Me5/em8對(duì)11種苔蘚植物的SRAP 擴(kuò)增結(jié)果M 1234567891011M 123456789101134

19、圖311種苔蘚植物的RAPD 分析聚類圖圖411種苔蘚植物的SRAP 分析聚類圖 341267591011 80510152025C A S E3412675910118Label Num 狀圖(圖3和圖4。從圖3和圖4可知,SRAP 和RAPD 的聚類結(jié)果都可將11種苔蘚植物分為3大類,且都將牛角蘚單獨(dú)劃為一類。在各大類中,凡屬同科的苔蘚植物都能很好的聚類在一起,如灰蘚科的黃灰蘚、灰蘚凹葉變種、鱗葉蘚和金灰蘚;青蘚科的多枝青蘚和彎葉青蘚;叢蘚科的擬溪邊扭口蘚和卷葉毛口蘚。這與形態(tài)學(xué)結(jié)果是一致的。特別是SRAP 對(duì)灰蘚科的分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果完全一致。從相似系數(shù)也可以看出(表3和表4,同科內(nèi)的

20、植物種類間的遺傳相似系數(shù)均高于它們與其它科植物間的相似系數(shù)。特別是黃灰蘚和灰蘚凹葉變種及多枝青蘚和彎葉青蘚在兩種標(biāo)記中均表現(xiàn)出很高的遺傳相似性。不同科之間的苔蘚植物表311種苔蘚植物SRAP 分析的相似系數(shù)樣品123456789101111.0000.4100.4560.4630.0590.2770.366-0.1000.1220.2010.13821.0000.3240.329-0.0670.1450.0820.011-0.085-0.0050.01131.0000.8410.0780.0830.350-0.0060.0460.0030.07841.000-0.0540.0260.280-0

21、.0540.0000.0260.02751.0000.0830.1130.1620.3070.0030.24661.0000.550-0.0780.3120.307 0.16471.000 -0.0440.1810.0210.19281.0000.0460.003-0.00691.0000.2280.133101.0000.244111.000表411種苔蘚植物RAPD 分析的相似系數(shù)樣品123456789 10111 1.0000.5970.4120.3540.2110.2730.2840.0820.3230.1710.02921.0000.4310.3600.1390.1770.2060.

22、2640.1550.0930.02931.0000.6690.0330.2530.163-0.0990.0440.050-0.01441.0000.2290.3040.2930.0250.0360.050-0.01251.0000.1630.2520.1180.2060.0730.13961.0000.6180.0270.0440.2400.11371.000-0.0130.0770.0730.07381.0000.0680.0070.07191.0000.155-0.034101.0000.288111.000張安世等:RAPD 和SRAP 標(biāo)記技術(shù)在苔蘚植物親緣關(guān)系研究中的比較分析35 中

23、國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)種類的相似系數(shù)很低,表明它們的遺傳差異較大。但在兩種聚類結(jié)果所劃分的3大類中,第1大類和第2大類的物種組成有所差異。在RAPD 的聚類結(jié)果中,第1大類包括灰蘚科的黃灰蘚、灰蘚凹葉變種、鱗葉蘚和金灰蘚;青蘚科的多枝青蘚和彎葉青蘚,以及大葉鳳尾蘚和小牛舌蘚全緣亞種。第2大類包括叢蘚科的擬溪邊扭口蘚和卷葉毛口蘚兩種。但在SRAP 的聚類結(jié)果中,將叢蘚科的擬溪邊扭口蘚、卷葉毛口蘚、鳳尾蘚科的大葉鳳尾蘚和牛舌蘚科小牛舌蘚全緣亞種劃歸為一類。形態(tài)學(xué)結(jié)果表明,小牛舌蘚全緣亞種、牛角蘚和青蘚科的多枝青蘚和彎葉青蘚與灰蘚科的黃灰蘚、灰蘚凹葉變種、鱗葉蘚和金灰蘚親緣關(guān)系較近,大葉鳳尾蘚和叢蘚科的擬溪邊扭

24、口蘚和卷葉毛口蘚親緣關(guān)系較近,因此,無(wú)論SRAP 還是RAPD 的分析結(jié)果都與形態(tài)學(xué)結(jié)果有一定差異,而且這種差異主要表現(xiàn)在科以上植物種類之間。3討論RAPD 和SRAP 等分子標(biāo)記技術(shù)已被證實(shí)是分析生物遺傳多樣性較為有效的方法。此研究表明,通過(guò)RAPD 和SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)得到的聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)果基本一致。說(shuō)明了不同標(biāo)記系統(tǒng)間得出的結(jié)論有很大的同一性,同時(shí)也說(shuō)明RAPD 和SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)可以較好的運(yùn)用到苔蘚植物的遺傳多樣性研究中,具有一定的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但兩者的分析結(jié)果均與形態(tài)學(xué)結(jié)果有一定的差異,原因可能是由DNA 分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記本身特點(diǎn)所造成的11。形態(tài)

25、學(xué)分類主要是依據(jù)植物的表型性狀,而表型性狀易受環(huán)境及基因顯隱性的影響,且控制這幾個(gè)形態(tài)特征的基因在整個(gè)基因組所占比例較小,不能充分反映植物的遺傳特征;而RAPD 和SRAP 分子標(biāo)記是通過(guò)多個(gè)不同的引物擴(kuò)增整個(gè)基因組,反映的是整個(gè)基因組結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性變化。由于形態(tài)學(xué)差異和分子水平的差異所經(jīng)受的進(jìn)化壓力不同,遵循的規(guī)律也不盡相同,因此,形態(tài)學(xué)上的差異并不一定是DNA 水平變異的真實(shí)反映12。此研究還表明,RAPD 和SRAP 的分析結(jié)果也存在一定的差異,兩者的差異主要表現(xiàn)在對(duì)大葉鳳尾蘚和小牛舌蘚全緣亞種的劃分上。按形態(tài)學(xué)結(jié)果,大葉鳳尾蘚應(yīng)劃在叢蘚科所在的一大類,而小牛舌蘚全緣亞種應(yīng)劃在牛角蘚與

26、青蘚科和灰蘚科所在的一大類中,SRAP 分析結(jié)果將小牛舌蘚全緣亞種劃在了叢蘚科所在的一大類,而RAPD 將大葉鳳尾蘚劃在了灰蘚科所在的一大類。因此,現(xiàn)行的任何一種檢測(cè)手段都不是萬(wàn)能的,都有一定的局限性,因此需要多種標(biāo)記方法相互結(jié)合、相互印證,才能得出客觀的結(jié)果。但就對(duì)灰蘚科的分析結(jié)果來(lái)看,SRAP 結(jié)果更為準(zhǔn)確,它與形態(tài)學(xué)結(jié)果完全一致,可能是由于SRAP 技術(shù)擴(kuò)增的是基因的重要組成部分開放閱讀框(ORFs ,因而更能反映遺傳資源的多樣性13。4結(jié)論利用RAPD 和SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)研究了11種苔蘚植物的親緣關(guān)系,并進(jìn)行了比較分析。兩種標(biāo)記的分析結(jié)果均與形態(tài)學(xué)結(jié)果基本一致,但也存在一定的差異

27、,這種差異主要表現(xiàn)在科以上種類之間。同時(shí),兩種標(biāo)記結(jié)果之間也存在一定差異,主要表現(xiàn)在對(duì)大葉鳳尾蘚和小牛舌蘚全緣亞種的劃分上。參考文獻(xiàn)1吳鵬程,賈渝,汪眉枝.中國(guó)與北美苔蘚植物區(qū)系關(guān)系的探討J.植物分類學(xué)報(bào),2001,39(6:526-539.2王艇,朱建明,蘇應(yīng)娟,等.部分苔蘚植物rbcL 基因PCR-RFLP 分析J.西北植物學(xué)報(bào),2000,20(6:968-973.3施定基,冉亮,寧葉,等.苔蘚分子生物學(xué)的一些進(jìn)展J.貴州科學(xué),2001,19(4:1-5.4王先平,胡勇,何奕昆.基因定點(diǎn)整合技術(shù)及其在苔蘚研究中的進(jìn)展J.植物學(xué)通報(bào),2003,20(2:137-143. 5沙偉,王艷麗,騰兆巖.毛尖紫萼蘚總RNA 提取方法的研究J.武漢植物學(xué)研究,2007,25(3:310-312.6沙