細胞生物學實驗技術一

1、整理課件動物細胞生物學實驗動物細胞生物學實驗技術技術整理課件主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)細胞的細胞生物學培養(yǎng)細胞的細胞生物學第二節(jié)第二節(jié) 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)第三節(jié)第三節(jié) 顯微鏡知識顯微鏡知識第四節(jié)第四節(jié) 細胞生物學實驗技術細胞生物學實驗技術整理課件第一節(jié)第一節(jié)培養(yǎng)細胞的細胞生物學培養(yǎng)細胞的細胞生物學整理課件主要內(nèi)容主要內(nèi)容（一）體內(nèi)、外細胞的差異（二）體外培養(yǎng)細胞的分型 （三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 整理課件 體外培養(yǎng)的細胞和體內(nèi)細胞的比較 相似：相似：仍存在仍存在細胞細胞和和細胞細胞、 細胞細胞和和基質基質的的相互關系相互關系 單個細胞雖能生長繁殖, 但不如群體細胞能力強不如群體

2、細胞能力強， 當相鄰細胞接觸，便導致運動停止 細胞相互溝通生物信息細胞相互溝通生物信息的結果 對細胞外基質細胞外基質仍有依存性 差異：差異：失去失去原有組織結構和細胞形態(tài)， 分化減弱或不明顯 整理課件 細胞外基質細胞外基質 存在于組織中，由細胞合成并分泌至胞外的成分，分布在分布在細胞表面或細胞之間的大分子，包括纖維性纖維性成分成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子空間充填分子(主要為糖胺聚糖)等，其對細胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。 這些物質構成復雜的網(wǎng)架結構，支持并連接支持并連接組織結構、調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。 整理課件

3、1影響細胞的存活、生長與死亡影響細胞的存活、生長與死亡 正常真核細胞，大多須粘附于特定的正常真核細胞，大多須粘附于特定的細胞外基質上才能細胞外基質上才能抑制凋亡而存活抑制凋亡而存活，稱，稱為定著依賴性（為定著依賴性（anchorage dependence）。）。例如，例如，上皮細胞及內(nèi)皮細胞上皮細胞及內(nèi)皮細胞一旦脫離了一旦脫離了細胞外基質則會發(fā)生程序性死亡。細胞外基質則會發(fā)生程序性死亡。整理課件2決定細胞的形狀決定細胞的形狀 細胞呈細胞呈單個游離單個游離狀態(tài)時多呈狀態(tài)時多呈球形球形。 同一種細胞在同一種細胞在不同的細胞外基質上不同的細胞外基質上粘附粘附時可表現(xiàn)出完全時可表現(xiàn)出完全不同的形狀不

4、同的形狀。 細胞外基質決定細胞的形狀這一作用是細胞外基質決定細胞的形狀這一作用是通過其通過其受體受體影響影響細胞骨架的組裝細胞骨架的組裝而實現(xiàn)而實現(xiàn)的。的。整理課件3控制細胞的分化控制細胞的分化 細胞通過與特定的細胞外基質成分作用細胞通過與特定的細胞外基質成分作用而發(fā)生分化。而發(fā)生分化。 例如，成肌細胞成肌細胞在纖粘連蛋白纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白層粘連蛋白上則停止增殖，進行分化，融合為肌管。整理課件 4參與細胞的遷移參與細胞的遷移 細胞外基質可以細胞外基質可以控制控制細胞遷移細胞遷移的的速度速度與與方向方向，并為細胞遷移提供，并為細胞遷移提供“腳手架腳手架”。 細胞的

5、遷移細胞的遷移依賴于依賴于細胞的粘附細胞的粘附與與細胞骨細胞骨架的組裝架的組裝。細胞粘附于一定的細胞外基。細胞粘附于一定的細胞外基質時質時誘導誘導粘著斑粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系的形成，粘著斑是聯(lián)系細胞外基質與細胞骨架細胞外基質與細胞骨架“鉚釘鉚釘”。 整理課件（一）體內(nèi)、外細胞的差異（一）體內(nèi)、外細胞的差異 體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細胞間相互影響體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細胞間相互影響 體外：缺乏動態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境體外：缺乏動態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境 發(fā)生的變化發(fā)生的變化 分化現(xiàn)象減弱分化現(xiàn)象減弱 形態(tài)功能趨于單一化形態(tài)功能趨于單一化 一定時間后死亡或者轉化獲得不死性一定時間后死亡或者轉化獲得不死性整

6、理課件 體外培養(yǎng)的細胞仍具有研究的意義 許多性狀仍與體內(nèi)相同 如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動， 細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應基因關閉基因關閉開啟開啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達與調(diào)控表達與調(diào)控提供線索。整理課件（二）體外培養(yǎng)細胞的分型（二）體外培養(yǎng)細胞的分型 貼附型：貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按體內(nèi)組織學標推判定 懸浮型：懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，白血病細胞，骨髓細胞或免疫細胞，不需要細胞間和細胞與培養(yǎng)表面的接觸 。整理課件 貼附型細胞的分類貼附型細胞的分類 成纖維細胞型成纖維細胞型 上皮型細胞上皮型細胞 游走細胞型

7、游走細胞型 多型細胞型多型細胞型整理課件 成纖維細胞型成纖維細胞型 梭型或不規(guī)則三角形，生長時呈放射狀。梭型或不規(guī)則三角形，生長時呈放射狀。 除真正的成纖維細胞外，凡由除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質中胚層間充質起源的組織，起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。 凡培養(yǎng)中凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似形態(tài)與成纖維類似時皆可稱為成纖維細胞。時皆可稱為成纖維細胞。整理課件整理課件 上皮型細胞：上皮型細胞： 扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，細胞很少單獨行動。細

8、胞很少單獨行動。 起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。整理課件 游走細胞型：游走細胞型： 散在生長，不連成片，散在生長，不連成片，呈活躍游走或變形運呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。動，方向不規(guī)則。 此型細胞不穩(wěn)定，有此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相時難以和其他細胞相區(qū)別。區(qū)別。整理課件 多型細胞型： 有一些細胞，如神經(jīng)有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。歸于此類。整理課件（三）培養(yǎng)細胞的生

9、長和增殖過程（三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程整理課件 培養(yǎng)細胞的生命周期培養(yǎng)細胞的生命周期 是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。 種類、供體的年齡等。種類、供體的年齡等。 人胚成纖維細胞可傳3050代，約150300個增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細胞僅可傳幾代 供體為成體或衰老個體，則生存時間較短； 肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。 當細胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。整理課件 生命周期的三個階段生命周期的三個階段 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 傳代期傳代期 衰

10、退期衰退期 整理課件 原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織從體內(nèi)取出組織, ,分離出細胞、接種培養(yǎng)分離出細胞、接種培養(yǎng) 到到 第一次傳代。第一次傳代。原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（Primary CulturePrimary Culture）期）期 原代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織細胞在原代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織細胞在形態(tài)結構形態(tài)結構和和功能上功能上相似性大相似性大。 特點特點 細胞群是異質的（細胞群是異質的（HeterogeneousHeterogeneous） 細胞克隆形成率（細胞克隆形成率（Cloning EfficiencyCloning Efficiency）低，即細胞獨立生）低，即細胞獨立生存性差。存性

11、差。 由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象好的實驗對象整理課件 原代培養(yǎng)分為兩種方法原代培養(yǎng)分為兩種方法 直接接種組織塊直接接種組織塊 由組織分離出細胞后接種由組織分離出細胞后接種整理課件整理課件組織塊接種：牛胎兒成纖維細胞整理課件 傳代期：傳代期： 原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系細胞系（Cell Line）。此期的持續(xù)時間最長。 在培養(yǎng)條件較好培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。 為保持二倍體細胞性質，細胞應在原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)期期或傳代后早期凍存凍存。 一般情況下當傳代1050次

12、左右，細胞細胞增殖增殖逐漸緩慢逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。整理課件 衰退期：衰退期： 增殖很慢增殖很慢或或不增殖不增殖，最后衰退，最后衰退凋亡凋亡。 少數(shù)情況下，細胞可能發(fā)生少數(shù)情況下，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化自發(fā)轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的轉化的標志標志之一是細胞可能獲得之一是細胞可能獲得永生性永生性（Immortality）或或惡性性質惡性性質（Malignancy）。這樣的細胞群這樣的細胞群體稱體稱無限細胞系無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。 無限細

13、胞系的形成主要發(fā)生在無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初第二期末，或第三期初階段。階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。整理課件細胞的一代生存期細胞的一代生存期1潛伏期潛伏期（Latent Phase） 2指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 3停滯期停滯期（Stagnate Phase） 整理課件1潛伏期（潛伏期（Latent Phase） 細胞接種培養(yǎng)后，先是細胞接種培養(yǎng)后，先是懸浮期懸浮期。此時細胞質回縮，胞體。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。呈圓球形。 接著細胞貼附于底物表面，

14、稱接著細胞貼附于底物表面，稱貼壁貼壁， 各種細胞各種細胞貼附速度不同貼附速度不同，這與細胞的，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分種類、培養(yǎng)基成分和和底物的理化性質底物的理化性質等密切相關。等密切相關。 經(jīng)過延展過程變成經(jīng)過延展過程變成極性細胞極性細胞 可運動，基本無增殖。可運動，基本無增殖。 細胞細胞接種密度大時潛伏期短。接種密度大時潛伏期短。 當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。指數(shù)增生期。整理課件不同的細胞貼壁的時間不同不同的細胞貼壁的時間不同如如巨噬細胞、成纖維細胞巨噬細胞、成纖維細胞等等粘附能力強粘附能力強, 能在數(shù)分鐘至

15、數(shù)能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如如神經(jīng)元細胞、羊水細胞，粘附能力弱神經(jīng)元細胞、羊水細胞，粘附能力弱, 需要數(shù)小時乃至需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面更長的時間才能粘附到固相表面可可利用利用此特點（粘附：快、牢；慢、弱）此特點（粘附：快、牢；慢、弱） 分離分離、純化細胞純化細胞 整理課件整理課件貼附過程 ：3步貼附因子粘附細胞開始附著細胞進一步牢固附著伸展整理課件 細胞貼壁影響因素 生物因素：生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機械機械、物理等物理等其他因素：其他因素： 流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞

16、附著 離心：促進附著離心：促進附著 低溫：可抑制附著低溫：可抑制附著整理課件 加速細胞貼壁的措施 包被培養(yǎng)皿底面：對分化程度高、生長能力差的細胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細胞粘附和生長的生物活性物質 如:-通過其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部, 培養(yǎng)的細胞再與其結合。 血清內(nèi)含有多種能夠促進細胞粘附的成分 減少接種時細胞懸液的量，待細胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液整理課件 培養(yǎng)液中離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于含量過低時不利于 細胞的粘附、貼壁和鋪展細胞的粘附、貼壁和鋪展 合適的培養(yǎng)溫度整理課件 細胞鋪展（伸展） (spread) 進行進行生命活動生命活動的

17、一種的一種基本的生長特點基本的生長特點或生長行為或生長行為 鋪展狀況鋪展狀況制約制約細胞的細胞的分裂增殖分裂增殖活動活動 鋪展的過程鋪展的過程 細胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細胞) 逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細，鋪展的越好與生長基質的表面接觸面越大 極性細胞極性細胞就是細胞就是細胞在體外在體外的的特征性細胞形態(tài)特征性細胞形態(tài) 鋪展狀況鋪展狀況與與細胞的生長細胞的生長有密切關系有密切關系 只有當只有當細胞鋪展細胞鋪展到到合適合適的的程度程度DNA合成合成才開始才開始進行進行整理課件2， 指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 是細胞是細胞增值最旺盛增值最旺

18、盛的階段，是細胞一代中活力最好的時的階段，是細胞一代中活力最好的時期期,是進行各種實驗最好的和最主要的階段。是進行各種實驗最好的和最主要的階段。 以細胞以細胞分裂指數(shù)分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）作為）作為判定判定細胞生細胞生長旺盛與否長旺盛與否的重要的重要標志標志。即每。即每1000個細胞中的分裂相數(shù)。個細胞中的分裂相數(shù)。 體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于裂指數(shù)介于0.1%0.5%，原代細胞分裂指數(shù)低，永，原代細胞分裂指數(shù)低，

19、永生細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達生細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%5%。pH和和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響 整理課件2， 指數(shù)增生期（指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 接觸抑制接觸抑制（Contact Inhibition） 由于細胞增殖細胞增殖而的相互接觸相互接觸，進而抑制抑制細胞的運動和增運動和增殖殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。正常與癌細胞標志之一。

20、接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個十分有趣的現(xiàn)象。當周接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個十分有趣的現(xiàn)象。當周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時,一旦上皮細胞互相接觸一旦上皮細胞互相接觸,就就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫接觸抑制接觸抑制。因此。因此,創(chuàng)面上創(chuàng)面上不會出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和不會出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和神秘神秘的的調(diào)控現(xiàn)象。調(diào)控現(xiàn)象。 整理課件接觸抑制接觸抑制（Contact inhibition） 細胞相互接觸時，將停細胞相互接觸時，將停止增長；止增長； 細胞停留在細胞周期的細胞停留在細胞周期的G0G0期；期； 轉化的細胞卻可以繼

21、續(xù)轉化的細胞卻可以繼續(xù)生長導致細胞重疊堆積生長導致細胞重疊堆積生長。生長。整理課件3停滯期（停滯期（Stagnate Phase）：）： 細胞數(shù)量數(shù)量達飽和密度飽和密度后，細胞遂停止增殖停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。 停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢

22、復后，才能再用。整理課件第二節(jié)、細胞培養(yǎng)第二節(jié)、細胞培養(yǎng)整理課件主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容（一）細胞培養(yǎng)所需條件（一）細胞培養(yǎng)所需條件（二）細胞培養(yǎng)所需用品（二）細胞培養(yǎng)所需用品（三）細胞培養(yǎng)液（三）細胞培養(yǎng)液（四）細胞的原代、繼代培養(yǎng)（四）細胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細胞的凍存和復蘇（五）細胞的凍存和復蘇（六）細胞污染（六）細胞污染整理課件（一）細胞培養(yǎng)所需條件（一）細胞培養(yǎng)所需條件 1 營養(yǎng)需要營養(yǎng)需要 2 細胞的生存環(huán)境細胞的生存環(huán)境 溫度溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓滲透壓 濕度濕度 3 無污染無污染 4

23、 無毒無毒整理課件（二）細胞培養(yǎng)所需用品：（二）細胞培養(yǎng)所需用品： 無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈 CO2培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 液氮罐 自動雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管整理課件1 1超凈工作臺超凈工作臺(Hood): A.水平流超凈工作臺水平流超凈工作臺(Horizontal air flow) B.垂直流超凈工作臺垂直流超凈工作臺(Lateral air flow)C.層流空氣超凈工作臺層流空氣超凈工作臺(Laminar air flow)整理課件水平流超凈工作臺背送風，但病毒是不實用的，容易對人有害整理課件垂直流

24、超凈工作臺整理課件整理課件超凈工作臺的清潔維護：超凈工作臺的清潔維護： 保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗完畢后，將所有的用品收藏起來用品收藏起來，工作臺上只留只留有酒精燈酒精燈及橡皮頭橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實驗結束后應先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。整理課件整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正正 確確 錯錯 誤誤整理課件接種過程中盡可能達到懸空要求接種過程中盡可能達到懸空要求防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤整理課件接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正正 確確 錯錯

25、 誤誤整理課件瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正正 確確 錯錯 誤誤整理課件2，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為培養(yǎng)箱設定的條件為37 ，100%濕度，濕度，5CO2 。使用使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題 用用螺旋口瓶螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松微松，以保證通氣。，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈空氣干凈。 定期消毒定期消毒（90 ，14 h)。 箱內(nèi)箱內(nèi)滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，毫升蒸餾水， 以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。發(fā)。整理

26、課件濕度以第二天第濕度以第二天第一次開門，能看一次開門，能看到玻璃門上的水到玻璃門上的水珠珠整理課件3 3消毒設備：消毒設備： A.A.高壓消毒鍋（高壓消毒鍋（AutoclaveAutoclave）：）：110 C110 C，15 lb15 lb，20 20 分鐘，分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9 lb9 lb， 10 10 分鐘）等。分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。 B.B.干熱消毒箱：干熱消毒箱：150-200 C150-200 C， 2 -32 -3小時。小時。 適合于玻璃器皿、金屬器械等。適合于玻璃器皿、

27、金屬器械等。C.C.酒精消毒酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛解剖器械、塑料器皿、動物皮毛 等，酒精濃度為等，酒精濃度為75759595 。 整理課件高壓消毒鍋高壓消毒鍋整理課件 D. D. 濾膜過濾：濾膜過濾：正壓過濾正壓過濾: : 蠕動泵通入培液；通入氣體。 負壓過濾：負壓過濾：用水泵或油泵抽濾。 濾膜孔徑為濾膜孔徑為0.22m0.22m，為延長濾膜壽命可同時添，為延長濾膜壽命可同時添加加0.45 m0.45 m和和1.2 m 1.2 m 濾膜。濾膜。整理課件濾 膜 濾 器整理課件兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）整理課件4. 4. 蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：蒸餾器與去離

28、子純水系統(tǒng)： 1 1）用三蒸水，通過去離子純水）用三蒸水，通過去離子純水 系統(tǒng)，電阻需達到系統(tǒng)，電阻需達到170170萬歐姆萬歐姆以上。以上。 2 2）專門的去離子水系統(tǒng)）專門的去離子水系統(tǒng)5. 5. 倒置相差顯微鏡：倒置相差顯微鏡： 需用需用相差鏡頭相差鏡頭和和濾光片濾光片，集光器的選擇應與接物鏡，集光器的選擇應與接物鏡的放大倍數(shù)一致。的放大倍數(shù)一致。整理課件純水系統(tǒng)純水系統(tǒng) 整理課件倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉整理課件5，培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)器皿整理課件培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶整理課件5，恒溫水浴箱，血，恒溫水浴箱，血清滅活，細胞解凍清滅活，細胞解凍整理課件6，移液管

29、，移液管整理課件整理課件整理課件7 7，低速離心機，低速離心機整理課件 RPMI-1640RPMI-1640（標準型）、（標準型）、DMEM-DMEM-高糖高糖（標準型）、（標準型）、DMEM-DMEM-低糖（標準型）、低糖（標準型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等整理課件Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3, 丙酮酸鈉、抗生素等整理課件Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進行分裝，避免反復凍融，血清保存要放置20整理課件培養(yǎng)液的選擇培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標準，有幾點建議可供參考沒

30、有一定的標準，有幾點建議可供參考 選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)這種細胞這種細胞首選的培養(yǎng)液?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細首選的培養(yǎng)液。可以查閱參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。胞株時咨詢。 其它實驗室其它實驗室慣用的培養(yǎng)液慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細胞。不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細胞。 用用多種培養(yǎng)液多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。方法，但比較繁瑣。 總之，首選總之，首選ME

31、M做粘附細胞培養(yǎng)、做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)，做懸浮細胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（SFM）。）。整理課件血清使用注意事項血清使用注意事項血清必須貯存于血清必須貯存于20 20 -70-70，若存放于，若存放于44，請勿超過一個月。，請勿超過一個月。血清血清解凍步驟解凍步驟( (逐步解凍法逐步解凍法): -20): -20或或7070至至44冰箱冰箱溶解一天，至溶解一天，至室溫室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻規(guī)則搖晃均勻( (小心勿造成氣小心勿造成氣泡泡) )，使溫度與成分

32、均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由2020直接至直接至3737解凍，因溫度改變太大，容易造成解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結蛋白質凝結而發(fā)生沉淀。而發(fā)生沉淀。熱滅活（熱滅活（heat-inactivationheat-inactivation）是指）是指56, 30 56, 30 分鐘分鐘加熱已完全解凍之加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之血清。目的是使血清中之補體成份補體成份(complement) (complement) 去活化。除非必須，去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清，

33、因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清之品質。之品質。勿將血清置于勿將血清置于3737太久，若在太久，若在3737放置太久，血清會變得混濁，同時放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較血清中許多較不穩(wěn)定之成份不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質亦會因此受到破壞，而影響血清之品質整理課件補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細胞溶解（抗體包裹細胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關系統(tǒng)。補體系統(tǒng)主要的功能是通過 在病原體表面的作用，破壞其細胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應。 加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激

34、平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。 整理課件凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點

35、”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 整理課件谷氨酰胺 L谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源能量來源、參與蛋白質的合成蛋白質的合成和核酸代謝核酸代謝。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L谷氨酰胺的降解導致氨的形成氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 配制方法為 ：谷氨酰

36、胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分攪拌溶解后（應加溫30），過濾除菌，分裝小瓶，-20-20保存保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM 整理課件整理課件l 由組織中分離細胞和細胞傳代l 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用整理課件 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用：使細胞間的主要作用：使細胞間的蛋白質水解蛋白質水解，使細胞相互離散，使細胞相互離散 消化細胞時，加入一些消化細胞時，加入一些血清血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用化作用 EDTA4NaEDT

37、A4Na 溶液溶液 一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便價格低廉，使用方便 常用工作液濃度為常用工作液濃度為0.020.02% %。 注意：注意：使用使用EDTA EDTA 處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的因殘留的EDTA EDTA 會影響細胞生長會影響細胞生長整理課件（四）細胞的原代和傳代培養(yǎng)（四）細胞的原代和傳代培養(yǎng)整理課件取材：取材：用用頸椎脫位法頸椎脫位法使使孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把整個孕鼠整個孕鼠浸入盛有浸入盛有7575乙醇乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘的燒杯

38、中數(shù)秒鐘消毒消毒，取出后放在大平皿中攜入，取出后放在大平皿中攜入超凈臺超凈臺。用消過毒的。用消過毒的剪刀剪刀在軀干中部環(huán)行剪開在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出皮膚，剖腹取出子宮子宮置于無菌平皿中。用消置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀過毒的剪刀剪開子宮，剪開子宮，取出取出鼠胎，鼠胎，剪去剪去頭、爪，頭、爪，以以平衡鹽溶液平衡鹽溶液洗去血洗去血污污切割：切割：用用PBSPBS將取出的將取出的組織塊組織塊清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組組織反復剪碎織反復剪碎，直到成，直到成1mm1mm3 3左右的小塊左右的小塊，再用，再用平衡鹽溶液平衡鹽溶液清洗，洗到組清洗，洗到

39、組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：消化、接種培養(yǎng)：加入加入0.250.25胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液（5-105-10倍量倍量），與組織），與組織塊混勻。置塊混勻。置3737水浴，觀察消化情況水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入靜止，吸去上清，加入5 510ml10ml細胞培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)整理課件全量換液和半量換液全量

40、換液和半量換液 換液時機的選擇：培養(yǎng)液培養(yǎng)液pH值：細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物值：細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質積累增多，質積累增多， pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細胞狀態(tài)細胞狀態(tài)細細 胞胞 換換 液液整理課件整理課件消化法傳代培養(yǎng)步驟整理課件整理課件冷凍細胞注意事項冷凍細胞注意事項凍存液配制凍存液配制 : 現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積凍存液體積：要小，0.5-1 ml凍存細胞數(shù)凍存細胞數(shù)：與正常傳代細胞數(shù)目要相當，避免復蘇后細胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度凍存速度： 降溫緩慢 4C，1030 min -20C，1 - 2 h -80C，1 hour 過夜 -19

41、6C，1- 2 year 完善記錄完善記錄：凍存細胞名稱，PD，凍存日期，凍 存人，存放位置，其它特殊信息等整理課件細胞凍存管，做好標記整理課件整理課件整理課件（六）細（六）細 胞胞 污污 染染 細菌污染 真菌污染 細菌和真菌的清除 支原體污染 支原體的清除整理課件細菌污染 細胞培養(yǎng)常見的污染細胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，培養(yǎng)液變混濁，p

42、H改變改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。死亡。 整理課件真菌污染真菌污染 真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。毒性作用而使細胞脫落死亡。 整理課件白色念珠菌（倒置顯微鏡下） 中間長梭型的是正在分裂的念珠菌 整理課件細菌和真菌的清除細菌和真菌的清除 使用抗生素使用抗生素 抗生素對殺滅細菌較有效?？股貙缂毦^有效。 聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。 預防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。預防用藥

43、比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 污染后清除用藥需采用大于常用量污染后清除用藥需采用大于常用量5 51010倍藥物沖洗倍藥物沖洗法，于加藥后作用法，于加藥后作用24244848小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。此法在污染早期有效。整理課件9595以上是以下四種支原體：以上是以下四種支原體：口腔支原體（口腔支原體（M.oraleM.orale）精氨酸支原體（精氨酸支原體（M.argininiM.arginini）豬鼻支原體（豬鼻支原體（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性問題，平均發(fā)生率達到世界性問題，平均發(fā)生率達到11%11%能改變細胞的能改變細胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表達及蛋白表達不能通過可視法對其進行檢測不能通過可視法對其進行檢測對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：來源：操作環(huán)境不良操作環(huán)境不良操作人員的疏失操作人員的疏失實驗器具不潔等實驗器具不潔等已受污染的細胞已受污染的細胞已受污染的培養(yǎng)基、血清已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染支原體污染整理課件熒光染色法熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)支原體培養(yǎng)