各期慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞成分與肺功能的關(guān)系

1、各期慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞成分與肺功能的關(guān)系                作者：曾勉, 劉凌云, 張式鴻, 謝燦茂, 王 輝, 黃曉梅  【摘要】  【目的】 比較不同時(shí)期慢性阻塞性肺?。–OPD）患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞組成的變化，及其誘導(dǎo)痰中細(xì)胞成分尤其中性粒細(xì)胞百分比與氣流受限的關(guān)系。【方法】 對(duì)110例COPD患者急性加重期COPD (AECOPD) 患者（A1組）62例、穩(wěn)定期COPD患者（B組）48例及30例健康對(duì)照者（

2、C組）進(jìn)行肺功能測(cè)定及痰誘導(dǎo)，痰液處理后沉渣作細(xì)胞學(xué)分析。其中AECOPD組在治療1周后（A2組）再次進(jìn)行上述指標(biāo)的測(cè)定?！窘Y(jié)果】 140例受試者中有21例因不能耐受痰誘導(dǎo)過程或痰標(biāo)本不合格而退出研究，最終有119例受試者完成本研究（A1,2組48例，B組43例，C組28例）。A1組、A2組、B組、C組誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)（10 6/ml）分別為（8.8 ± 3.7）、（6.5 ± 2.6）、（5.0 ± 2.8）、（2.8 ± 1.3），細(xì)胞分類中A1組、A2組、B組以中性粒細(xì)胞為主，分別為（66 ± 15）、（60 ± 10）、（55

3、 ± 11），而在C組中則以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主，分別為（37 ± 10）、（32 ± 8）；AECOPD患者（A1組、A2組）誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分比與肺功能指標(biāo)（FEV1、FEV1pre、FVC、FEV1/FVC）呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.860、-0.682、-0.662、-0.300，P 0.001）；穩(wěn)定期組（B組）中性粒細(xì)胞與FEV1、FEV1pre負(fù)相關(guān)（r分別為-0.346 、-0.421, P 0.05），對(duì)照組中性粒細(xì)胞與肺功能無相關(guān)性(P 0.05)?！窘Y(jié)論】 AECOPD、緩解期、穩(wěn)定期患者誘導(dǎo)痰細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，健康者誘導(dǎo)痰細(xì)胞以巨噬

4、細(xì)胞為主；氣道局部中性粒細(xì)胞增多與各期COPD患者氣流受限存在密切的關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  阻塞性肺疾病；誘導(dǎo)痰；中性粒細(xì)胞   慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)1。由不同炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性氣道炎癥，會(huì)進(jìn)一步引發(fā)氣道阻塞和氣道重構(gòu)，對(duì)COPD發(fā)生發(fā)展起著重要作用。已證實(shí)誘導(dǎo)痰法是一種非侵入性、安全、簡(jiǎn)便易行直接測(cè)定氣道炎癥的方法，已廣泛用于哮喘的臨床研究及診治中，近年來，誘導(dǎo)痰技術(shù)在COP

5、D氣道局部炎癥機(jī)制研究中的應(yīng)用越來越受重視，其安全性和有效性也得到證實(shí)2,3。但目前較多關(guān)注的是誘導(dǎo)痰中炎癥因子、炎性介質(zhì)在COPD中的作用，而誘導(dǎo)痰中細(xì)胞成分的變化及其與各期COPD氣流受限的關(guān)系研究報(bào)道較少，尤其COPD急性加重期誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)分析未見報(bào)道。我們通過觀察COPD急性加重期、緩解期和穩(wěn)定期患者及健康對(duì)照組誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類的變化，及其與肺功能的關(guān)系，來闡明氣道局部炎癥細(xì)胞在COPD中的作用。    1   材料和方法   1.1   研究對(duì)象   收集2004

6、年10月至2006年03月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科門診及住院的110例COPD患者及30例健康對(duì)照組（C組）。COPD患者中急性加重期患者（A1組）62例，COPD穩(wěn)定期患者（B組）48例。緩解組（A2組）指上述AECOPD組病人經(jīng)正規(guī)治療1周后臨床癥狀緩解者。穩(wěn)定期組（B組）病人指患者咳嗽、咳痰、氣促等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微持續(xù)2個(gè)月以上者；2周內(nèi)無呼吸道感染，未使用全身激素及抗生素。健康對(duì)照組（C組）：選擇年齡匹配（年齡±2)，非呼吸系統(tǒng)疾病的健康人群。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有COPD患者均符合COPD全球創(chuàng)議（GOLD）1,4的診斷標(biāo)準(zhǔn)（支氣管舒張?jiān)囼?yàn)后FEV180%預(yù)計(jì)值，F(xiàn)EV1/FV

7、C 70%）。AECOPD患者均符合ATS/ERS的AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn)2,4。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外哮喘、支氣管擴(kuò)張、腫瘤、結(jié)締組織病、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病。合并高血壓病、嚴(yán)重左、右心功能衰竭（心功能、級(jí)）者不納入研究范圍。凡符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者告知本研究的目的及試驗(yàn)方法，簽署知情同意書。   1.2   研究方法   根據(jù)Pin等的改良方法，我們制定了痰誘導(dǎo)及痰液處理規(guī)范操作流程。受試者在誘導(dǎo)前測(cè)定FEV1，然后吸入200 g沙丁胺醇，15 min后測(cè)定FEV1作為基礎(chǔ)值，在室溫下CSW-1型超聲霧化器（汕頭光電研究所，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)YY/

8、TO109-93）吸入3高滲鹽水2 min后，用雙氧水漱口，深咳痰液入無菌容器中；繼續(xù)吸入3高滲鹽水，間隔3 min測(cè)FEV1和連續(xù)監(jiān)測(cè)脈搏血氧飽和度（SpO2），收集痰液至少1克以上。取無唾液成分的痰液放入離心管中，加入4倍體積的0.1DTT孵育，螺旋振蕩15 min，3 500 r / min (r=15 cm)，離心20 min。沉淀細(xì)胞用Hanks液懸浮，在血細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)（Trypan）排除法測(cè)定細(xì)胞是否存活及存活率，細(xì)胞存活率50為合格標(biāo)本。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮密度至1×106，將75 l懸浮液置于細(xì)胞離心機(jī),450 r/min (r=15 cm)，離心6 min

9、，細(xì)胞沉渣涂片，風(fēng)干，吉姆薩染色，每張涂片計(jì)數(shù)400個(gè)非鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)算分類，鱗狀上皮細(xì)胞 20者為合格標(biāo)本，提示痰來源于下呼吸道，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。COPD患者的舒張?jiān)囼?yàn)及所有受試者的肺功能使用肺功能儀（Sensor Medics Ltd, USA）進(jìn)行測(cè)定。痰誘導(dǎo)過程中監(jiān)測(cè)FEV1采用便攜式肺功能儀（Micro Medical公司，英國(guó)），SpO2用便攜式脈搏容積血氧飽和度儀（Osaka公司，日本）。   1.3   統(tǒng)計(jì)學(xué)處理   各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANO

10、VA）、組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)，粒細(xì)胞數(shù)與肺功能的關(guān)系用Spearman相關(guān)分析；所有數(shù)據(jù)的計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 13.0軟件處理，以 P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。            2   結(jié)   果   2.1   患者一般情況和肺功能分級(jí)   入選的的110例COPD患者均符合COPD中-重度標(biāo)準(zhǔn)。其中AECOPD患者62例，穩(wěn)定期患者48例，健康對(duì)

11、照組30例。   62例AECOPD患者入院當(dāng)天和治療1周后（緩解期）分別進(jìn)行痰誘導(dǎo)，其中有14例患者不能耐受痰誘導(dǎo)過程或痰標(biāo)本不合格而退出研究，最終順利完成痰誘導(dǎo)且痰標(biāo)本合格患者有48例；48例穩(wěn)定期組(C組)退出研究5例，順利完成痰誘導(dǎo)且痰標(biāo)本合格患者43例；30例對(duì)照組（C組）納入研究有28例，2例因痰標(biāo)本不合格而退出。各組性別、年齡、FEV1、FEV1占預(yù)計(jì)值和FEV1/FVC等數(shù)值詳見表1。   四組間性別、年齡無差異（P 0.05）；AECOPD治療前后肺功能的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P0.01，治療后，肺功能明顯改善。四組間FEV1和FEV1

12、占預(yù)計(jì)值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P 0.01，穩(wěn)定期肺功能好于緩解期，緩解期好于加重期（表1）。   2.2   各組誘導(dǎo)痰液的細(xì)胞分類情況   對(duì)照組誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類中，巨噬細(xì)胞占（37.1 ± 9.8）%，明顯高于中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞比例；各期COPD中性粒細(xì)胞比例明顯高于其他細(xì)胞比例，隨著病情的好轉(zhuǎn)，肺功能改善，由加重期、緩解期、穩(wěn)定期痰液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)依次下降，但仍高于對(duì)照組，P 0.05。而淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞變化不大（表2）。   2.3   誘導(dǎo)痰細(xì)胞成

13、分與肺功能的相關(guān)性   各組誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞比例與FEV1、FEV1pre、FVC、FEV1/FVC的相關(guān)性見表3。從表3可見AECOPD（A1、A2組）中性粒細(xì)胞與FEV1、FEV1pre、FVC、FEV1/FVC皆呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.860、-0.682、-0.662、-0.300，P 0.001）；COPD穩(wěn)定期組（B組）中性粒細(xì)胞與FEV1、FEV1pre、FVC、FEV1/FVC也呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不如AECOPD組；各組散點(diǎn)具線形趨勢(shì)。對(duì)照組中性粒細(xì)胞比例與肺功能各指標(biāo)無相關(guān)性，P 0.05。    3  

14、; 討   論   COPD是多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與的氣道炎癥。通過誘導(dǎo)排痰法檢測(cè)有關(guān)炎癥細(xì)胞和介質(zhì)指標(biāo)，闡明局部氣道炎癥與氣流受限的關(guān)系，已證實(shí)是一種非侵入性、簡(jiǎn)便可行的新方法。誘導(dǎo)痰標(biāo)本是否來自下氣道、痰標(biāo)本是否合格主要通過誘導(dǎo)痰的細(xì)胞學(xué)檢查來判斷，目前常用的標(biāo)準(zhǔn)是：每低倍鏡視野下痰標(biāo)本的白細(xì)胞數(shù) 25個(gè)、鱗狀上皮細(xì)胞 10個(gè)，吉姆薩染色后每張涂片計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞其中鱗狀上皮細(xì)胞 20且細(xì)胞存活率 50為合格標(biāo)本。本研究亦采取此標(biāo)準(zhǔn)為判斷痰標(biāo)本是否合格的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示9例痰標(biāo)本細(xì)胞存活率 50而退出研究。   誘導(dǎo)痰的來源與自

15、發(fā)排痰、支氣管肺泡灌洗液、支氣管活檢的部位不同，主要來源于外周氣道至中央氣道的分泌物，反映了氣道分泌物自然狀態(tài)下的濃度，具有更集中的細(xì)胞和生化物質(zhì)成分，尤適合氣道炎癥疾病如COPD、哮喘的研究。健康人及不同呼吸道疾病其誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類的比例存在明顯的差異，反映了不同疾病發(fā)病機(jī)制的差異。健康人群誘導(dǎo)痰中以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主，哮喘患者誘導(dǎo)痰中以嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，而COPD患者誘導(dǎo)痰中則以中性粒細(xì)胞為主。我們的研究中還發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期、緩解期、穩(wěn)定期誘導(dǎo)痰中均以中性粒細(xì)胞為主，分別為（66.1 ±  15.1）、（60.3 ± 10.0）、

16、（55.3 ± 11.7），嗜酸性細(xì)胞變化不大，健康對(duì)照組中則以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主，分別為（37.1 ± 9.8）、（31.7 ±  8.1），但中性粒細(xì)胞比例不如COPD高，與Balzano及ODonnell的結(jié)果基本類似。本研究發(fā)現(xiàn)各期COPD的中性粒細(xì)胞的百分比與FEV1、FEV1pre、FVC、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，以加重期組相關(guān)性更明顯，對(duì)照組中性粒細(xì)胞與肺功能無相關(guān)。本研究COPD加重期中性粒細(xì)胞明顯增高，經(jīng)治療癥狀緩解后，誘導(dǎo)痰的中性粒細(xì)胞雖有明顯下降從（66.1 ± 15.1）降至（60.3 ± 10.0），

17、（P 0.05），但其數(shù)值仍高于對(duì)照組，穩(wěn)定期中性粒細(xì)胞數(shù)也明顯高于對(duì)照組（P 0.05），提示中性粒細(xì)胞不僅在COPD加重期對(duì)氣道炎癥及氣流受限中起重要作用，而且促使緩解期和穩(wěn)定期氣道炎癥持續(xù)存在。COPD氣流受限增加主要在小支氣管和細(xì)支氣管，中性粒細(xì)胞這些部位浸潤(rùn)，釋放炎癥介質(zhì)、多種蛋白酶，從而誘導(dǎo)氣道分泌細(xì)胞分泌粘液，引起一系列炎癥反應(yīng)，加重氣流受限。同時(shí)痰液中中性粒細(xì)胞增加而嗜酸性細(xì)胞無增加也反映了部分患者對(duì)激素治療的抵抗作用。但有報(bào)道10一些COPD加重期痰液中嗜酸性粒細(xì)胞增加，吸入激素后痰中嗜酸性細(xì)胞比例和嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白降低。因此，定期檢測(cè)COPD患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞分類，嗜酸性細(xì)

18、胞比例可估測(cè)藥物的效果。   本研究進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)排痰法的安全性和可行性，共110例COPD患者進(jìn)行了該項(xiàng)操作，91例患者安全渡過全過程并且痰標(biāo)本合格。誘導(dǎo)痰液顯示了各期COPD患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞組成的變化，AECOPD患者誘導(dǎo)痰中的中性粒細(xì)胞與肺功能明顯相關(guān)，從炎癥細(xì)胞角度說明氣道局部炎癥在COPD氣流受限中的作用，為COPD的抗炎治療尤其是抗中性粒細(xì)胞的治療提供依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  FABBRI L M, HURD S S； GOLD SCIENTIFIC COMMITTEE. Global strategy for the diagnosis, managem

19、ent, and prevention of COPD 2003 update J. Eur Resp J, 2003，22(1):1-2.曾 勉, 吳健鋒, 謝燦茂，等. 慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者規(guī)范化痰誘導(dǎo)安全性的初步研究J. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（4）: 238-241.SUTHERLAND E R, PAK J, Langmack E L, et al. Safety of sputum induction in moderate-to-severe chronic obstructive pulmonary disease J. Respir Med, 2002, 96(7): 482-486.CELLI B R, MACNEE W, ATS/ERS TASK FORCE. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper J. Eur Respir J, 2004， 23(6):932-946.KIPS J C, INMAN M D, JAY