反相高效液相色譜法同時(shí)測定參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯

1、反相高效液相色譜法同時(shí)測定參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的含量                    作者：葛建，樓紀(jì)東，林芳，黃麗紅，姜威，李明揆，盧秀蓮【摘要】  目的建立一種同時(shí)測定白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的高效液相色譜檢測方法，并分析中成藥參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的含量。方法樣品采用液-液萃取，以乙腈-水（5050）為流動(dòng)相，流速1.0 ml? min-1，采用SHIMADZ

2、U ODS柱（150 mm×4.6 mm; 5 m）色譜柱分離；檢測波長220 nm。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.550.0 g?ml-1，線性關(guān)系良好(r>0.99)，定量限為0.5 g/ml，回收率98%以上，方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度均較好（RSD<3%）。結(jié)論該法操作簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，已經(jīng)成功地用于中成藥參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的含量測定。 【關(guān)鍵詞】  白術(shù)內(nèi)酯 白術(shù)內(nèi)酯 高效液相色譜-紫外檢測法 參苓白術(shù)顆粒Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC-UV method for the simultaneo

3、us determination of atractylenolide II and III and to detect the content of atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation.MethodsAfter a simple liquid-liquid extraction, atractylenolide II and III were separated on SHIMADZU C18 column(4.6 mm×150 mm, 5 m) and detected by UV spectro

4、metry. The detection wavelength was set at 220 nm. The mobile phase consisted of acetonitrile-water (5050) at a flow rate of 1.0 ml?min-1. The content of atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation(Shenling Baizhu Granule) was simultaneously determined by the method above after simpl

5、e liquid-liquid extraction.ResultsThe linear calibration curves were obtained in the concentration range of 0.550.0 g?ml-1(r>0.99). The lower limit of quantification was 0.5 g?ml-1. The recoveries were more than 98.0%, and the stability, repeatability and precision of the method were all better i

6、n all cases（RSD<3%）. ConclusionThe RP-HPLC method is specific, simple, sensitive and accurate. And this method was successfuly applied to simultaneously quantitate atractylenolide II and III in Chinese medicinal preparation (Shenling Baizhu Granule).Key words：Atractylenolide II;   Atrac

7、tylenolide III;   RP-HPLC; Shenling Baizhu Granule參苓白術(shù)顆粒由人參、白術(shù)（炒）、茯苓等中藥組成，具有補(bǔ)脾胃，益肺氣的功效，用于脾胃虛弱，食少便溏，氣短咳嗽，肢倦乏力1。白術(shù)為本方中重要組成部分，白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，為常用大宗藥材，著名的“浙八味”之一2。其味苦、甘,性溫,歸脾胃經(jīng),功能健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎,為補(bǔ)益類補(bǔ)氣藥3。白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯為白術(shù)中的有效成分，該類物質(zhì)具有抗炎、抗腫瘤作用4。此外該類成分還具有調(diào)節(jié)胃腸道功能和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸

8、引的功能5。有學(xué)者采用了人參皂苷6作為檢測指標(biāo)來對其進(jìn)行質(zhì)量控制。為了加強(qiáng)對該藥物的質(zhì)量控制，本研究建立了同時(shí)測定該中成藥中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的方法，以此來進(jìn)一步加強(qiáng)對參苓白術(shù)顆粒等含有白術(shù)類中成藥的質(zhì)量管理。1  器材LC-20AT高效液相色譜儀（日本，島津），SPD-20A UV/Vis檢測器，浙江大學(xué)智達(dá)N2000色譜工作站，Shim-pack VP-ODS色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 m），Hettich Mikro 22R超高速低溫離心機(jī)（德國），SHBZ-IIIA型循環(huán)水真空泵，KQ-250B型超聲波儀（昆山超聲儀器有限公司），YKH-型漩渦混合器（上

9、海精科實(shí)業(yè)有限公司）。    白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯對照品均由實(shí)驗(yàn)室自制（圖1），純度分別為99.8%和98.5%，色譜乙腈、色譜甲醇購自杭州嘉辰化工有限公司；參苓白術(shù)顆粒，北京漢典制藥有限公司（批號：07030101）。2 方法2.1 色譜條件色譜柱為Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 m），保護(hù)柱(4.6 mm×12.5 mm，5 m)；檢測波長220 nm；流動(dòng)相為乙腈-水=50-50（V/V）；流速1.0 ml?min-1；柱溫30，進(jìn)樣量20 l。2.2 供試品溶液的制備取參苓白術(shù)顆粒粉末 (過40目篩) 約

10、2.0 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加甲醇10 ml，稱定重量，超聲提取30 min，室溫下靜置30 min，補(bǔ)足減失的重量，上清液過0.45 m微孔濾膜后，得供試品溶液。2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍將分別溶解于甲醇中的白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯貯備液混合稀釋成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0g?ml-1的白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯系列標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣得到白術(shù)內(nèi)酯、和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，分別以白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯峰面積與對應(yīng)兩種化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，求出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)。2.4 加樣回收率稱取一定量已知白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯含量的該中成藥顆粒粉末，共6份，精密加入白術(shù)內(nèi)酯對照品和白術(shù)內(nèi)

11、酯對照品適量。按“2.2”項(xiàng)下操作，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算平均加樣回收率。百事通2.5 方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度取同一批樣品（批號：07030101）按“2.2”項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液，在上述所確定的RP-HPLC條件下，分別于配制后0，1，4，6，24h吸取供試品20 l進(jìn)樣分析，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯在供試品溶液中的穩(wěn)定性；取同一批樣品5份，按上述方法分別制備供試品溶液，各進(jìn)樣20 l，計(jì)算方法的重復(fù)性；將上述供試品溶液吸取20 l進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算方法精密度。3 結(jié)果3.1 色譜行為與色譜圖在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜分離條件下，白術(shù)內(nèi)酯II和II

12、I的保留時(shí)間分別為21.615 min和10.365 min，標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)過處理后的參苓白術(shù)顆粒樣品進(jìn)HPLC分析的色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處色譜峰均較好（圖2）。3.2 流動(dòng)相和檢測波長的選擇本研究曾考察了甲醇-水=60-40（V/V）、乙腈-水=50-50（V/V）以及乙腈-水=60-40（V/V）作為流動(dòng)相，結(jié)果表明只有采用乙腈-水=50-50（V/V）作為流動(dòng)相白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯能夠很好的分離。本分析方法曾分別嘗試了209，220 nm和237 nm作為檢測器的檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在209 nm和237 nm波長處，白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的吸收峰均小于220 nm處，故本研究采用220 nm作為檢

13、測器檢測波長。3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立以及方法確證在0.550.0 g?ml-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：白術(shù)內(nèi)酯：Y= 47 443X+9 491.4  r=0.999 9白術(shù)內(nèi)酯：Y= 35 385X+5 843.8  r=0.999 9在上述制備的供試品溶液分別進(jìn)樣分析后，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯和峰面積變化的RSD，求得分析方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度（表1），結(jié)果表明所建立的分析方法重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度均較好。白術(shù)內(nèi)酯的平均回收率為102.38，RSD為1.92；白術(shù)內(nèi)酯的平均回收率為 98.58，RSD為2.43，測定結(jié)果表明本品回收率好，方法可行

14、。表1  分析方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度（略）3.4  參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯含量的測定取3個(gè)批次參苓白術(shù)顆粒粉末2.0 g，精密稱定，按“2.2”制成供試品溶液，按上述高效液相色譜條件，吸取20 l進(jìn)樣，計(jì)算白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的量，結(jié)果參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯II含量為0.000253%（RSD=0.59%），白術(shù)內(nèi)酯III含量為0.000 7%（RSD=2.54%）。研究結(jié)果表明參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯類化合物含量均較低，可能是由于該中成藥的制備工藝中白術(shù)炮制方法為炒白術(shù)，由于白術(shù)內(nèi)酯類化合物均為揮發(fā)油類，所以當(dāng)炒制白術(shù)時(shí)，大量的白術(shù)內(nèi)酯類揮發(fā)油被揮發(fā)或發(fā)

15、生了化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成了其它成分，因此中成藥中白術(shù)內(nèi)酯類化合物含量較低。4  結(jié)論本研究建立一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的白術(shù)內(nèi)酯和白術(shù)內(nèi)酯的RP-HPLC分析方法，并將該分析方法應(yīng)用于中成藥參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯和的含量檢測，該研究為中成藥參苓白術(shù)顆粒的質(zhì)量控制提供一個(gè)新的途徑和檢測手段，同時(shí)該研究還可以為進(jìn)一步加強(qiáng)含白術(shù)類中成藥質(zhì)量控制提供方法和手段。【參考文獻(xiàn)】  1劉中國，閆欣，馬宏，等. 參苓白術(shù)顆粒治療脾胃虛弱證的療效與安全性多中心對照研究J. 中國藥物與臨床，2007，7（2）：126.2彭華勝,王德群.白術(shù)道地藥材的形成與變遷J.中國中藥雜志,2004,29（12）:1133.3魏緒剛, 孟慶芬. 對蒼術(shù)白術(shù)出典問題的探討J. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2002，13（3）：166.4Ching-Chiung Wang, Shyr-Yi Lin, Huey-Chuan Cheng，et al.Pro-o