低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因、丁基膽堿酯酶基因與Alzhei

1、    低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因、丁基膽堿酯酶 基因與Alzheimer病的相關(guān)性研究        【摘要】目的探討中國(guó)漢族人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)基因、丁基膽堿酯酶(BCHE)基因多態(tài)性與Alzheimer病(AD)的相關(guān)情況。方法 應(yīng)用PCR-RFLP方法，在38例AD患者和40名正常人中觀察LRP和BCHE基因多態(tài)性的分布，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果AD患者LRP基因C/C純合子基因型頻率及等位基因C頻率均高于對(duì)照組(P<0.05)，AD患者B

2、CHE基因各基因型頻率及等位基因頻率與對(duì)照組比較均無顯著性差異。結(jié)論中國(guó)人群中，LRP基因多態(tài)性與AD呈正相關(guān)；BCHE基因多態(tài)性與AD發(fā)病無關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】Alzheimer病低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因丁基膽堿酯酶基因 Study on the relationship between LRP gene,BCHE gene and Alzheimer diseaseBi Sheng, Zhang Yu,Wu JiangDepartment of Neurology,the First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin 1

3、50001【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between LRP gene,BCHE gene polymorphism and Alzheimer disease(AD) in Chinese.MethodsThe gene polymorphism distribution of LRP and BCHE was observed in 38 AD patients and 40 controls with PCR-RFLP methods,and was analysed relatedly as well.Resul

4、tsThe frequencies of LRP gene C/C homozygote genotype and C allele in AD patients were higher than in the controls (P<0.05),There was no remarkable difference between each genotype frepuency of BCHE gene,the frepuency of allele in AD patients and the controls.ConclusionsIn Chinese LRP gene polymo

5、rphism was positive correlation to AD.There was no association between BCHE gene polymorphism and AD.【Key words】Alzheimer diseaseLRP geneBCHE gene Alzheimer病(AD)具有遺傳異質(zhì)性。在腦組織中，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)作為載脂蛋白E(apoE)的主要受體，參與神經(jīng)修復(fù)過程中脂類的修復(fù)作用。近年發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦內(nèi)老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和淀粉樣血管病變中發(fā)現(xiàn)有丁基膽堿酯酶(BCHE)活性的改變1，2。因此，作為AD的兩種病理伴隨性物

6、質(zhì)，LRP基因、BCHE基因與AD的相互關(guān)系受到了普遍關(guān)注。我國(guó)尚未見這方面的報(bào)道。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，觀察AD患者LRP基因和BCHE基因多態(tài)性的分布，并對(duì)它們與AD的相互關(guān)系及在AD患者中的相互影響進(jìn)行探討。1對(duì)象與方法1.1對(duì)象AD組38例，男21例，女17例，年齡6079歲，平均70.2±6.7歲；均為1997年10月1999年2月在哈醫(yī)大一院和白求恩醫(yī)大一院神經(jīng)科門診和住院治療的AD患者，根據(jù)美國(guó)精神病學(xué)會(huì)診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)(DSM-IV)作出癡呆的診斷，再根據(jù)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和AD及相關(guān)疾病協(xié)

7、會(huì)(NINCDS-ADRDA)3標(biāo)準(zhǔn)作出AD的診斷。對(duì)照組40名，男24名，女16名，年齡6081歲，平均68.1±4.3歲。均為健康老年人，兩組研究對(duì)象均為隨機(jī)選擇，無血緣關(guān)系。1.2方法1.2.1基因組DNA的提取按常規(guī)方法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。1.2.2LRP基因型檢測(cè)4引物為5'-GGGGTCCAGGACTGCATGTA-3'和5'-AAGT-CCGTACCTCGGCAGTG-3'。PCR反應(yīng)體積為25 l，內(nèi)含50 ng基因組DNA，1.25 U Taq DNA聚合酶，200 mol/L dNTPs，引物各0.25 mol/L，反應(yīng)程

8、序?yàn)?43分鐘，32周期(9430秒，5430秒，7230秒)，723 分鐘。取PCR產(chǎn)物(59 bp) 5 l，加5 U RsaI內(nèi)切酶，37酶切過夜后，12非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，產(chǎn)生兩種不同長(zhǎng)度的片段，只有51 bp片段的可視為純合基因型T/T，只有32 bp片段的可視為純合基因型C/C，有51 bp和32 bp兩個(gè)片段的可視為雜合基因型C/T（1）。1LRP基因型檢測(cè)結(jié)果1純合基因型T/T；2純合基因型C/C;3雜合基因型C/T;4PCR產(chǎn)物(分子量大小為59 bp)；M核苷酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322DNA/Hae1.2.3BCHE基因型檢測(cè)5引物為5'-ATAT

9、TTTACAGGAAATATTGATGTA-3'和5'-ATTAGAGACCCACACAACTT-3'。PCR反應(yīng)體積為25 l，內(nèi)含50 ng基因組 DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，200 mol/L dNTPs，引物各0.25 mol/L，反應(yīng)程序?yàn)?41 分鐘，35周期(9420秒,5320秒，7220秒)。取PCR產(chǎn)物(137 bp) 5 l，加5U Mae內(nèi)切酶，37酶切過夜后，2瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，產(chǎn)生兩種不同長(zhǎng)度的片段，只有137 bp片段的（無酶切位點(diǎn)）可視為純合基因型 W/W，只有115 bp片段的可視為純合基因型 K/K，有115 b

10、p和137 bp兩個(gè)片段的可視為雜合基因型 K/W（2）。2BCHE基因型檢測(cè)結(jié)果1純合基因型W/W;2、3純合基因型K/K;4雜合基因型K/W；M核苷酸分子量標(biāo)準(zhǔn)pBR322DNA/Msp1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算各等位基因和基因型頻率的分布；吻合度檢驗(yàn)確定是否符合Hardy-Weinberg平衡；計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)率(RR)；對(duì)AD與LRP基因或BCHE基因多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。2結(jié)果2.1AD患者與正常人LRP各等位基因和基因型頻率分布見表1。結(jié)果表明：AD與等位基因C正關(guān)聯(lián)(RR=2.648，P<0.05)；與基因型C/C正關(guān)聯(lián)(RR=2.952，P<0.05)。表1各組低密度脂蛋白

11、受體相關(guān)蛋白(LRP)基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型等位基因C/CC/TT/TCTAD組380.816*0.1580.0260.895*0.105對(duì)照組400.6000.3250.0750.7630.237與對(duì)照組比較*P<0.052.2AD患者與正常人BCHE各等位基因和基因型頻率分布見表2。結(jié)果表明：AD與BCHE各等位基因、基因型均無關(guān)聯(lián)(均P>?0.05)。表2各組丁基膽堿酯酶(BCHE)基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型等位基因W/WW/KK/KWKAD組380.6320.3420.0260.8030.197對(duì)照組400.6250.3250.0500.7880

12、.2122.3BCHE基因多態(tài)性在LRP基因各基因型中的分布見表3。結(jié)果表明：在3種LRP基因型中，BCHE基因多態(tài)性均與AD無關(guān)聯(lián)。表33種BCHE基因型在LRP基因各基因型中的分布(例）基因型LRP C/CLRP C/TT/TAD組對(duì)照組AD組對(duì)照組W/W191659W/K11726K/K11013討論在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，LRP是apoE的主要受體。LRP基因位于第12號(hào)染色體上，全長(zhǎng)92 Kb，由89個(gè)外顯子組成。LRP基因外顯子3的多態(tài)性位點(diǎn)位于LRP cDNA的第766核苷酸，由鹼基C或T構(gòu)成，相應(yīng)地產(chǎn)生3種LRP基因型：C/C、C/T和T/T。這種多態(tài)性變化不改變氨基酸的序列，不產(chǎn)生

13、或破壞限制酶切位點(diǎn)6。本研究在中國(guó)漢族人群中檢測(cè)了LRP基因多態(tài)性與AD的相互關(guān)系，并對(duì)AD患者中兩者間的相互影響進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)LRP等位基因C、基因型 C/C與AD正關(guān)聯(lián)，此與文獻(xiàn)6,7報(bào)道一致；表明中國(guó)人LRP基因多態(tài)性與AD關(guān)聯(lián)是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中過度表達(dá)，導(dǎo)致AD組與對(duì)照組比較產(chǎn)生顯著性差異(P?0.05)。BCHE基因位于第 3號(hào)染色體上，至少存在7種以上的遺傳變異。BCHE基因的多態(tài)性位點(diǎn)位于BCHE cDNA的第1615核苷酸，由鹼基G或A構(gòu)成，相應(yīng)地產(chǎn)生3種BCHE基因型：W/W、K/W和K/K。當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生由G到A的替代時(shí)，會(huì)發(fā)生Ala 539

14、Thr氨基酸替代，同時(shí)使得BCHE的活性降低。Lehmann等8報(bào)道攜帶有較高頻率的BCHE-K的患者易患AD，而本研究發(fā)現(xiàn)BCHE-K多態(tài)與AD無關(guān)聯(lián)；表明在中國(guó)人群中，BCHE基因多態(tài)性并不構(gòu)成AD的危險(xiǎn)因子。這與文獻(xiàn)9，10報(bào)道相符，可能由于BCHE基因多態(tài)受很多因素，如種族、地理環(huán)境等的影響，值得進(jìn)一步探討。 另外，在AD患者中，BCHE基因多態(tài)性與LRP基因多態(tài)性之間無明顯的相互影響。目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) LRP基因多態(tài)性是AD發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因子，初步顯示BCHE基因與AD遺傳易感性無關(guān)。我們擬在有關(guān)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探索AD的病因及與診斷或預(yù)測(cè)有關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)。作者單位：畢勝

15、（150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）王德生（150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）盛雨辰（150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）張昱（白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）吳江（白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）王守春（白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科）參 考 文 獻(xiàn)1.Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of Alzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord,1995,9:232.Gomez-Ramos P, Bouras

16、C, Moran MA. Ultrastructural localization of butyrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients.Brain Res,1994,640:173.McKhann G,Drachman D,Folstein M,et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:report of the NINCDS-ADRDA Wo

17、rk Group under the Auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology ,1984,34:9394.Hollenbach E, Ackermann S, Hyman BT, et al. Confirmation of an association between a polymorphism in exon 3 of the low- density lipoprotein receptor-related protein ge

18、ne and Alzheimer's disease .Neurology,1998,50:19055.Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M. Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification-created restriction site.Hum Hered,1996,46:266.Kang DE,Saitoh T,Chen X,et al.Genetic association of the low-density lipoprotein receptor-related protein gene(LRP) , an apolipoprotein E receptor,with late-onset Alzheimer's disease.Neurology,1997,49:567.Lambert JC,Wavrant-de Vrieze F,Amouyel P, et al. Association at LRP locus with spo