厭氧培養(yǎng)方法

1、厭氧性細(xì)菌的分離培養(yǎng)法厭氧菌需有較低的氧化還原勢能才能生長（例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化還原電勢降低至0.11V時才開始生長），在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長。為使培養(yǎng)基降低勢，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的?，F(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主要有生物學(xué)，化學(xué)和物理學(xué)3種方法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。1 生物學(xué)方法培養(yǎng)基中含有植物組織（如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等）或動物組織（新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等），由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗氧氣（如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這個原理），組織中所

2、含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化還原電勢下降。另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長將氧消耗后，使厭氧菌能生長。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌（如枯草桿菌），另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37恒溫箱中培養(yǎng)23d后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。2 化學(xué)方法利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收，或用還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電勢。此法系用連二亞硫酸納（Sodiumhydrosulphite）和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣，其反應(yīng)式如下：Na2s204十Na2c03十O2Na2SO4十Na2SO3

3、十C02取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)（如系液體培養(yǎng)基，則直立于罐內(nèi)），最上端保留可容納12個平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內(nèi)水分過多。若用無蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉（如圖15）。（2）焦性沒食子酸法焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食橙（Purpurgallin）。每l00cm3空間用焦性沒食子酸1g及10氫氧化納或氫氧化鉀l0

4、ml，其具體方法主要有下列幾種：1 ）單個培養(yǎng)皿法：將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在其上放焦性沒食子酸0.2g及10NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于其上，周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人37C溫箱培養(yǎng)2448h后，取出觀察。2 ）Buchner氏試管法：取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中，迅速加入20NaOH溶液0.5ml，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍封以石蠟，37培養(yǎng)2448h后觀察（圖16）。3 ）玻罐或干燥器法：置適量焦性沒食子酸于一干

5、燥器或玻罐的隔板下面，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，并在玻罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管，從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準(zhǔn)備好后將線放下，使焦性沒食子酸落人氫氧化納溶液中，立即將蓋蓋好；封緊，置溫箱中培養(yǎng)。4)瑞(Wright)氏法：將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后，塞人管中離培養(yǎng)基115cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)(圖17)。5)史(Spray)氏法：用圖18所示的厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置氫氧化鈉溶液，將已接種的

6、平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封完全，然后搖動底部，使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。6)平皿法：置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養(yǎng)(圖1-9)o7)硫乙醇酸鈉法硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑，加入培養(yǎng)基中，能除去其中的氧或還原性物質(zhì)，促使厭氧菌生長。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。A液體培養(yǎng)基法：將細(xì)菌種人含0.1的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)2448h后觀察，本培養(yǎng)基中加美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍(lán)被還原成無色。B.固體培

7、養(yǎng)基法：常采用特殊構(gòu)造的Brewer培養(yǎng)皿，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長而形成孤立的菌落；操作過程是先將Brewer氏皿干熱滅菌，將溶化且冷卻至50左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人皿內(nèi)。待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸(圖110)。此時皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故仍呈藍(lán)色。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37恒溫箱內(nèi)，經(jīng)過2448h后觀察。3物理學(xué)方法利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長發(fā)

8、育。(1)厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer氏罐，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐(圖111)。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個厭氧罐放人孵育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。(2)真空干燥器法將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中，開動抽氣機(jī)，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w。將整個干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng)。(3)高層瓊脂法加熱融化高層瓊脂，冷至45左右接種厭氧菌，迅速混合均勻。冷凝后37培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長。(4)加熱密封法將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱l0min，驅(qū)除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無菌凡士林石蠟，置37培養(yǎng)。此外，尚有搖振培養(yǎng)法，此處從略。(5)二氧化碳培養(yǎng)法少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌（牛型）等，孵育時，需大氣中添加510二氧化碳，方能使之生長繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；最簡單的二氧化碳培養(yǎng)法