酶標(biāo)抗體技術(shù)

1、酶標(biāo)抗體制備技術(shù)基本要求是將酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應(yīng)活性， 也不影響酶的生物化學(xué)活性。 用于標(biāo)記抗體的酶較多，常用的有辣根過氧化物酶、 堿性磷酸酶、 葡萄糖氧化物酶和 -半乳糖苷酶等。（一）辣根過氧化物酶標(biāo)抗體制備技術(shù)辣根過氧化物酶（ horseradish peroxidase ， HRP）廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由無色酶蛋白和深棕色鐵卟啉（輔基）構(gòu)成一種糖蛋白（含糖 18%）。此酶溶于水和 50%飽和度以下的硫酸銨溶液。HRP 分子量較?。?40kDa），標(biāo)記物容易穿透入細(xì)胞內(nèi)部；作用底物為H2O2，以二氨基聯(lián)苯胺（ DAB）為供氫

2、體的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察；在12 范圍內(nèi)穩(wěn)定，對熱及有機(jī)溶劑的作用亦較穩(wěn)定，能耐受 63 加熱 15min ；用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及 10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性；溶解性好，100mL 緩沖鹽溶液中可溶解 5gHRP，并可溶解于 62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級沉淀法分離純化；氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對 HRP 的活性有抑制作用，應(yīng)避免使用NaN3 作為酶標(biāo)試劑的防腐劑，以防止失活。凡能在 HRP和 H2O2 存在時被酶催化H2O2 反應(yīng)而和成有色產(chǎn)物的化合物（供氫體）都可以用顯色劑。供氫體的產(chǎn)物分不溶性和可

3、溶性兩類。前者最常用的為 3， 3二氨基聯(lián)苯胺(3,3 diaminobenzidine,DAB)，適用于免疫組化法；反應(yīng)后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產(chǎn)物，適用電鏡檢查；此外還有飽和聯(lián)苯胺溶液，氧化后產(chǎn)物呈黃褐色，多用于酶免疫擴(kuò)散的深沉線顯色。后者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylene diamine,OPD) ，產(chǎn)物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm ，可用肉眼判別；易被濃酸終止反應(yīng)，顏色可數(shù)小時不變，是ELISA中最常用的一種；但對光敏感，使用時要避光，并發(fā)現(xiàn)有致癌作用。用 HRP 標(biāo)記抗體需借助交

4、聯(lián)劑的作用，將酶連接在抗體分子上。常用的交聯(lián)劑為過碘酸鈉和戊二醛 (glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO) 。1、改良過碘酸鈉法HRP 分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff 堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2， 4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘存的-和 -氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉(NaHB4）還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。 標(biāo)記步驟 （ 1）取 5mg HRP 溶于蒸餾水，加入1%2，4 而二硝基氟苯（DNFB）無水乙醇溶液，室溫（20±）下輕微攪拌作用1h。（ 2）加入 1

5、mL L NaIO4，室溫下避光輕攪30min ，溶液呈黃綠色。（ 3）加入 L 乙二醇，室溫（20±）下輕攪作用1 h，終止氧化反應(yīng)。（ 4）加入 5mg 抗體（ Ig），裝入透析袋，置L，碳酸鹽緩沖液（無水碳酸鈉，碳酸氫鈉,蒸餾水加至1 000 mL） 1 000 mL 中， 4透析過夜，更換3 次。（ 5）取出透析袋中液體（約3 mL），加入5mg/mLNaHB4mL 4 2h或過夜。（ 6）加 50%飽和硫酸銨（NH4） 2SO4 溶液（硫酸銨850g，蒸餾水加至1 000 mL，以 30%氨水調(diào)） 6 mL 沉淀結(jié)合物，置離心 30min ，取深沉（ SPA 不需要進(jìn)行此步

6、）。4 30min后，3 000r/min（ 7）將沉淀物溶于PBS（ ）中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h ，換液 3 次。（ 8）在結(jié)合物內(nèi)加入 BSA至蛋白濃度為 10mg/ mL ，或加等量 60%甘油，測定工作效價后，小量分裝（或凍干，不需加甘油），低溫保存?zhèn)溆谩?、戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑， 通過它的兩個醛基分別與 HRP 和抗體蛋白的氨基結(jié)合， 形成 HRP-戊二醛 -Ab 蛋白結(jié)合物。 反應(yīng)可在 4-40 溫度范圍， 的緩沖溶液中進(jìn)行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標(biāo)記抗體混合，同時加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。戊二醛二步法是將酶先與戊二

7、醛作用，形成酶 -戊二醛結(jié)合物，結(jié)過透析或?qū)游龀ノ唇Y(jié)合的戊二醛，然后再與抗體結(jié)合。 標(biāo)記步驟 （ 1）取 10mgHRP 溶于 %戊二醛 (用 L、將 25%戊二醛稀釋為 %)，室溫（ 20 左右）反應(yīng)結(jié)合 18h。（ 2）用 LNaCl 平衡過的 Sephadex G-50 凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用 L， 4 透析過夜。（ 3）將 5mg 抗體 IgG 溶于 L NaCl，再與醛化HRP溶液（ 10mg/mL ）混合。（ 4）加入1mol/L碳酸鹽緩沖液（調(diào)節(jié)pH 至）， 4 ，電磁攪拌下結(jié)合 24h 。（ 5）加入賴氨酸（溶于 10mL 蒸餾水）， 4 放置 2h，以封閉殘留的

8、醛基，終止反應(yīng)。（ 6）裝入透析袋，以L、 PBS， 4 透析過夜，或通過Sephadex G-200凝膠柱層析，用PBS 洗脫，收集第1 峰洗脫液，加入等量60%甘油，測工作效價后，小量分裝，4或 -20保存。（二）過氧化物酶簡介抗過氧化物復(fù)合物制備技術(shù)Stemberger(1970) 等，首先報道了過氧化物酶- 抗過氧化物酶復(fù)合物（ peroxidase-antiperoxidase,PAP ）法，此法也稱為非標(biāo)記抗體酶法（ unlabelled antibody enzymemethod ）。 PAP 法不需用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，二者活性不受化學(xué)反應(yīng)的影響，可大大提高免疫酶法的靈

9、敏度。標(biāo)記步驟（ 1）取 5mL 抗 HRP 血清， 16 000r/min 4 離心 20min ，取上清液。（ 2）加入 1mL HRP(2mg/mL) 溶液混勻，室溫（ 20±）靜置 1h， 16000r/min ， 4離心 20min ，取沉淀物。（ 3）加冷生理鹽水反復(fù)洗滌 -離心（ 16 000r/min ， 4 離心 20min ） 3次，棄上清，取沉淀物。（ 4）加入過量HRP溶液 4mL（ 2mg/mL ）混勻后，移至小燒杯內(nèi)。（ 5）在 pH 計監(jiān)控下，邊攪拌邊加入及L HCl 調(diào)至左右，使沉淀完全溶解。（ 6）立即加入 LnaOH,調(diào)， 16 000r/min

10、， 4 離心 20min ，取上清液。（ 7）加入 1/10 體積的 L 醋酸鈉和 L 醋酸銨的等量混合液后混勻。（ 8）電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，并繼續(xù)攪拌 10min ，4放置 20min ， 16 000r/min ， 4 離心 20min ，去上清，取深沉物。（ 9）以 50%飽和硫酸銨洗滌， 4 、 16 000r/min ×20min，離心 2 次，取深沉物。（ 10 ）加 5mL 蒸餾水將深沉物溶解后裝入透析袋，用醋酸鹽緩沖液（生理鹽水、蒸餾水、 75mL L 醋酸鈉及 75mL 粉酶 3moL/L 醋酸銨） 4透析 3d ，每天換液 2 次。（ 11 ）

11、17 000r/min ， 4 離心 20min ，取上清液進(jìn)行工作效價鑒定。（ 12 ）加等量 60%甘油，小量分裝， -20 保存。（三） McAb-PAP 制備技術(shù)用抗 HRP McAb 制備 PAP 復(fù)合物的工藝條件較為簡便，而且不需嚴(yán)格的條件限制。用小鼠抗HRP McAb 制備的腹水，按一定的HRP/IgG 克分子比混和，置 37 水浴反應(yīng)2h，即成鼠PAP 復(fù)合物。以按HRP/IgG 克分子比為4 1 制備為宜。（四）堿性磷酸酶標(biāo)抗體制備技術(shù)簡介堿性磷酸酶（ alkaline phosphatase ，AP），系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，由多個同功酶組成。

12、從小牛腸粘膜提取的 AP 分子量為 100kDa，酶作用的最適 pH 為；從大腸桿菌中提取酶分子量為 80kDa ，最適 pH 為。它的作用底物較多，常用的酶底物有對硝基本磷酸鹽（ PNP）、 -甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。 AP 主要用作雙標(biāo)記染色，研究遞質(zhì)共存及酶名疫測定。 AP 標(biāo)記抗體，一般采用戊二醛作交聯(lián)劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個醛基結(jié)合。標(biāo)記步驟（ 1）取抗體（ 2 5mg/mL ） 1mL，加入 AP 5mg 溶解。（ 2）裝入透析袋，用 L、 透析 18h ，換液 3 次。（ 3）加入 %戊二醛 20uL，室溫（ 20±）放置 2h 。 4L、透析過

13、夜，換液 3次。（ 4）移入 L、緩沖液中， 4 透析過夜，換液 3 次。（ 5）取出標(biāo)記抗體， 用含 %BSA和 %NaN3 的 Tris-HCl 緩沖液稀釋至4mL，即為酶標(biāo)記物原液。（ 6）加入 1/3 量純甘油，測定工作效價后，小量（）分裝， 4保存 （使用前以吐溫溶液將結(jié)合物適當(dāng)稀釋）。（五）堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物制備技術(shù)Mason等（ 1978），用堿性磷酸酶代替過氧化物酶，建立了堿性磷酸酶 -抗堿性磷酸酶復(fù)合物（ APAAP）橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)。但以 AP 作為抗原用常規(guī)免疫方法制備的抗血清，很難達(dá)到APAPP 橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)的質(zhì)量要求，在一定程度上限制了此項技術(shù)的推廣使用。楊志剛等（ 1989 ）利用抗 AP 的 McAb建立了一種制備APAAP 復(fù)合物的簡便方法。只需將AP 和抗