長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UCA1通過(guò)miR-18a靶向YAP1調(diào)控乳腺癌曲妥珠單抗耐藥

1、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA-UCA1通過(guò) miR-18a 靶向 YAP1調(diào)控乳腺癌曲妥珠單抗耐藥【背景】據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示, 乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位。人表皮生長(zhǎng)因子受體2( 英文名為 Humanepidermal growth factorreceptor-2,英文簡(jiǎn)稱為 HER2)在約 20%25%乳腺癌患者中過(guò)度表達(dá) , 與疾病進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān) , 是乳腺癌治療的重要靶點(diǎn)之一。HER2靶向藥物曲妥珠單抗 (Trastuzumab, 商品名 Herceptin,赫賽汀 ) 在乳腺癌治療中具有較大的臨床獲益。 最近的研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在調(diào)控腫瘤耐藥方面發(fā)揮重要作用。微小

2、 RNA(miRNA)通過(guò)靶向降解靶mRNA調(diào)控基因表達(dá)。我們連續(xù)的研究表明 ,miR-200c(Baiet al,IntJ Cancer,2014) 、 miR-221(Ye et al,BMB Rep,2014)和 miR-375(Ye et al,BMC Cancer,2014)等廣泛參與乳腺癌HER2靶向治療的耐藥調(diào)控。這些結(jié)果說(shuō)明 miRNA在乳腺癌 HER2靶向治療耐藥中扮演重要角色。然而 ,miRNA僅僅是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的一個(gè)作用環(huán)節(jié) , 并不能完全解釋乳腺癌 HER2靶向治療耐藥相關(guān)基因的異常表達(dá)。近年來(lái) , 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)

3、 被證明在多種疾病中調(diào)控基因異常表達(dá) , 且與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤藥物耐藥性有關(guān)。然而 , 是否有與曲妥珠單抗耐藥有關(guān)的 LncRNA同時(shí)調(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 ?LncRNA與 miRNA以及靶基因的 mRNA如何相互作用 ?這些 RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又是如何參與乳腺癌耐藥 ?這些問(wèn)題目前仍未闡明。瘢痕疙瘩是一種皮膚良性腫瘤, 其特征是成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)和膠原過(guò)度沉積在受損傷的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)中。許多研究表明PPAR-激動(dòng)劑在腎臟、肝臟、胰腺和肺部具有抗纖維化作用, 表明 PPAR-激動(dòng)劑可能成為一種有前途的控制纖維化疾病的藥物。人工合成的 PPAR-激活劑 , 如曲格列酮等能

4、激活PPAR-。 PPAR-是核受體 , 能夠與靶基因的 DNA上的過(guò)氧化物酶體增殖激素應(yīng)答元件 (PPRE)結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄 , 從而調(diào)節(jié)多種生理現(xiàn)象。然而 , 盡管我們認(rèn)識(shí)到 PPAR-激動(dòng)劑抗纖維化的功能 , 但是在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中 PPAR-激動(dòng)劑抗纖維化作用的分子機(jī)制仍有待確定。研究顯示 , 部分微小 RNA(miRNA)具有調(diào)控纖維化的作用。我們連續(xù)的研究表明 ,miR-21 和 miR-145 廣泛參與皮膚纖維化進(jìn)程。然而,是否有與 PPAR-激動(dòng)劑治療抗纖維化作用有關(guān)的miRNA參與瘢痕發(fā)生 ?PPAR-激動(dòng)劑如何在瘢痕疙瘩中調(diào)控miRNA?miRNA以及靶基因又是如何參與PP

5、AR-激動(dòng)劑拮抗瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原生成?這些問(wèn)題亟需解答?！灸康摹客ㄟ^(guò)本研究的實(shí)施, 鑒定乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中與耐藥相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA,并篩選出受到該長(zhǎng)鏈非編碼RNA調(diào)控的 miRNA分子以及靶基因 , 進(jìn)而從 LncRNA“海綿吸附” miRNA的機(jī)制出發(fā) , 探討長(zhǎng)鏈非編碼 RNA在乳腺癌耐藥過(guò)程中的功能 , 并為乳腺癌治療提供新的靶點(diǎn)分子和策略。通過(guò)本研究的實(shí)施 , 驗(yàn)證 PPAR-激動(dòng)劑抑制瘢痕疙瘩膠原合成的現(xiàn)象 , 并篩選出受到 PPAR-激動(dòng)劑調(diào)控的 miRNA分子及其靶基因 , 探討靶基因 Egr1 對(duì)膠原生成的影響 , 并為瘢痕疙瘩治療提供新的候選靶點(diǎn)?！痉椒ā?/p>

6、1. 采用 qRT-PCR分析 UCA1、miR-18a 和 YAP1的表達(dá) ;2. 通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析 UCA1對(duì)曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌 SKBR3細(xì)胞增殖的影響 , 并測(cè)定曲妥珠單抗半數(shù)致死濃度 ;3. 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析檢測(cè)UCA1對(duì)曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌 SKBR3細(xì)胞凋亡的影響 ;4. 通過(guò) Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析UCA1對(duì)曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌SKBR3細(xì)胞侵襲能力的影響 ;5. 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)UCA1和 miR-18a、miR-18a 和 YAP1的結(jié)合位點(diǎn) ;6. 利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析UCA1和 miR-18a、miR-18a 和 YAP1的結(jié)合情

7、況 ;7. 采用生物素下拉實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UCA1和 miR-18a 相互結(jié)合 ;8. 采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析干涉 UCA1、miR-18a 和 YAP1的表達(dá)對(duì)上下游基因表達(dá)的影響。 1. 采用 qRT-PCR分析 Egr1、 miRNA和 Col1 的表達(dá) ;2.通過(guò)蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Egr1 和 Col1 蛋白含量 ;3. 通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘢痕疙瘩與正常皮膚組織中Egr1 的表達(dá) ;4. 通過(guò) miRNA芯片高通量篩選PPAR-激動(dòng)劑處理后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜 , 篩選出能夠調(diào)控膠原的 miRNA分子 (miR-543);5.通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)miRNA對(duì)膠原分泌的影響

8、;6. 通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPAR-在 miR-543 啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合 ;7. 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) miR-543 啟動(dòng)子區(qū)的過(guò)氧化物酶體增殖激素應(yīng)答元件序列, 以及miR-543 和 Egr1 的結(jié)合位點(diǎn) ;8. 利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-543 和 Egr1結(jié)合情況?！窘Y(jié)果】 1.qRT-PCR結(jié)果顯示 , 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA-UCA1在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌 SKBR3細(xì)胞中表達(dá)升高 ;2.UCA1 干涉結(jié)果顯示 , 干涉后長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UCA1在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌SKBR3細(xì)胞中顯著降低 ;3. 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示 ,UCA1干涉顯著降低曲妥

9、珠單抗耐藥的乳腺癌SKBR3細(xì)胞增殖和侵襲能力 ;4. 生物素 RNA下拉結(jié)果顯示 ,UCA1和 miR-18a 在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌 SKBR3細(xì)胞中相互結(jié)合 ;5. 生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)UCA1能“海綿吸附” miR-18a, 并且這種吸附作用依賴兩者的結(jié)合位點(diǎn);6.qRT-PCR結(jié)果顯示 , 降低 UCA1能顯著升高 miR-18a 的水平 , 而升高的 miR-18a 抑制 YAP1的表達(dá) ;7. 生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-18a 能靶向抑制YAP1,并且這種抑制作用依賴于兩者的結(jié)合位點(diǎn);8.qRT-PCR 和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 , 降

10、低 UCA1和 YAP1能顯著抑制促細(xì)胞分裂的分子的表達(dá), 提高促藥物敏感性蛋白的表達(dá)量 ;9. 干涉 UCA1實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) , 在 miR-18a 干涉的條件下 ,UCA1不能對(duì)miR-18a 下游基因進(jìn)行調(diào)控。 1.qRT-PCR結(jié)果顯示 , 在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中 ,Egr1 和 Col1 在接受 PPAR-刺激下降低 , 而 miR-543 表達(dá)升高 ;2. 蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示 ,Egr1 和 Col1 蛋白表達(dá)水平一致 ;3.miRNA 芯片結(jié)果顯示 ,miR-543 等 miRNA在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)異常 ,qRT-PCR證實(shí)了芯片檢測(cè)結(jié)果 ;4. 生物信息學(xué)結(jié)果顯示 ,miR-543 啟動(dòng)子區(qū)有過(guò)氧化物酶體增殖激素應(yīng)答元件序列 , 在 Egr1 的 3UTR區(qū)有 miR-543 的候選結(jié)合位點(diǎn) ;5.