S2實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基及其配制理論Word版

1、實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基及其配制（理論）一、培養(yǎng)基成分及作用培養(yǎng)基（culture medium）是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的重要因素之一。培養(yǎng)基成分對(duì)離體培養(yǎng)植物的生長發(fā)育起調(diào)控作用。選擇合適的培養(yǎng)基并掌握正確的制備方法是組織培養(yǎng)成功的前提。（一）植物必需的營養(yǎng)元素植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：1、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；2、構(gòu)成一些特殊的勝利活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；3、這些元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點(diǎn)化學(xué)方面的作用；1 / 164、在發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)

2、發(fā)生和組織、器官建成。Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充改元素來預(yù)防和恢復(fù)C、改元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為：大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)

3、重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種。微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg。 Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種。（二）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及作用培養(yǎng)基是外植體生長的土壤，它所含有的不同營養(yǎng)元素直接影響著培養(yǎng)材料的生長發(fā)育。 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素以有機(jī)物和無機(jī)物兩類形式存在，絕大多數(shù)營養(yǎng)元素以無機(jī)物的形式存在。 按照國際植物生理協(xié)會(huì)的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位

4、置，又稱生命元素。在培養(yǎng)基中主要以NO3-N和NH4-N兩種形式存在。P是磷脂主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。培養(yǎng)基中常以KCl、KNO3等鹽類提供。Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO47H2O提供，用量為13mg/L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。常以CaCl2H2O提供。2、微量元素在微量元素中，鐵的使用最大，鐵是一些氧化酶的組成成分。同時(shí)

5、又是葉綠素形成的必要條件。由于培養(yǎng)基的pH較高，所以培養(yǎng)中幾乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸鐵這種鰲合物來防止鐵的沉淀。硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系；銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長；錳參與植物的光合、呼吸代謝；鉬參與氮素的代謝；氯是光合作用水光解的活化劑。微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨~緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。 缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的細(xì)枝

6、。 缺錳典型癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。 缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦缺硼典型癥狀： 受精不良,籽粒減少 ，“花而不實(shí)”， “蕾而不花”；根尖、莖尖的生長點(diǎn)停止生長，而形成簇生狀；常引起各種腐爛病。 3、碳源碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最重要。一般來說，蔗糖是最好的糖源，它具有熱易變的性質(zhì)，經(jīng)高壓滅菌后，大部分分解為D-葡萄糖、D-果糖，僅剩下部分的蔗糖，這更利于吸收和利用。蔗糖使用濃度一般在2%5%。此外，糖還可以提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓

7、，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓一般在1.54.1 MPa。4、維生素類這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長，分化等有很好的促進(jìn)作用。主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素。5、肌醇又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用，是細(xì)胞壁的構(gòu)建材料。肌醇參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng)，具有促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用的效果，在培養(yǎng)基中加入1.0mg/L的肌醇就足以影響VB1的效應(yīng)。使用濃度一般在50100mg/L。6、氨基酸氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸，還有其他氨基酸，用量一般在101000mg/L之間。7、天

8、然復(fù)合物為了促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長，在培養(yǎng)基中還常加入多種化學(xué)成分不明的、復(fù)雜的天然營養(yǎng)混合物，如水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物等。8、瓊脂為使培養(yǎng)材料在培養(yǎng)基上固定和生長，要外加一些支持物，構(gòu)成固體培養(yǎng)基。瓊脂是使用最普遍的凝固劑。用量一般在610g/L之間，以顏色淺、透明度高好，潔凈為上品。除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。9、活性炭培養(yǎng)基中加入活性炭主要是為了吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)。加入適量的活性炭對(duì)抑制外植體褐變、防止玻璃苗的產(chǎn)生、促進(jìn)培養(yǎng)物生長和分化、促進(jìn)生根具有一定作用。但活性炭也有副作用，它的吸附作用沒有選擇性，所以在吸附抑制物的同時(shí)，使一

9、些營養(yǎng)成分也吸附了。10、抗生素主要目的是防止外植體內(nèi)生菌造成的污染。11、生長素類 主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂，還有促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí)等作用。在職物組織培養(yǎng)中，主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成、根的分化以及細(xì)胞的分裂和伸長。生長素一般溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，以后者的溶解效果更好。常用的生長素有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。12、細(xì)胞分裂素類細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢(shì)的變化和莖芽的分化等。主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不芽的形成，延緩組織的衰老并增

10、強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成。還用于離體成花的調(diào)控。細(xì)胞分裂素一般溶于0.51.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中。常用的細(xì)胞分裂素有KT (激動(dòng)素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素等。13、赤霉素類和脫落酸在組織培養(yǎng)中不常使用。赤霉素主要作用是加速細(xì)胞的伸長生長，也促進(jìn)細(xì)胞的分裂。主要是GA3。脫落酸具有抑制細(xì)胞分裂和伸長、促進(jìn)脫落和衰老、促進(jìn)休眠和提高抗逆能力等作用。二、培養(yǎng)基的分類與配制（一）培養(yǎng)基的種類根據(jù)培養(yǎng)基的形態(tài)不同可以分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)過程不同可以分為初代培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基；根據(jù)其作用不同可以分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基；根據(jù)其營養(yǎng)水平

11、不同則分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。（二）幾種常見培養(yǎng)基的特點(diǎn)1、MS培養(yǎng)基 特點(diǎn)是無機(jī)鹽濃度高，具有高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽的用量很大，同時(shí)還含有一定數(shù)量的銨鹽，營養(yǎng)豐富，不需要添加更多的有機(jī)附加物。2、White培養(yǎng)基 是1943年White設(shè)計(jì)的，1963年做了改良，特點(diǎn)是無機(jī)鹽濃度較低。使用廣泛，在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果。3、B5培養(yǎng)基 是1968年由Gamborg等設(shè)計(jì)的，特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。4、N6培養(yǎng)基 是1974年由我國的朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，特點(diǎn)是KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬。（三）培養(yǎng)基的配制配制培養(yǎng)基

12、應(yīng)做好幾點(diǎn)工作：1、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)備；2、試劑、藥品的準(zhǔn)備。3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量。具體操作如下：1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水或去離子水至培養(yǎng)基最終體積的3/4，在恒溫水浴中加熱使之溶解，并不斷攪拌，防止瓊脂凝塊兒。配制液體培養(yǎng)基時(shí)因不含凝固劑，無須高溫加熱。2、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻。吸取各種母液的移液器應(yīng)專用，以免產(chǎn)生交叉感染。對(duì)高溫高壓條件下不穩(wěn)

13、定或容易分解的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)必須在培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌后，用過濾的方法加入。3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻。在標(biāo)準(zhǔn)溫度下將培養(yǎng)基定容后進(jìn)行稱量，并以此質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行較高溫度的培養(yǎng)基的定容。4、調(diào)整培養(yǎng)基的pH值。一般采用1mol/LNaOH與1mol/LHCl來調(diào)整其pH值。5、分裝。已經(jīng)配制好的培養(yǎng)基應(yīng)盡快的分裝，以防止含瓊脂的培養(yǎng)基在較低溫度下凝固。分裝時(shí)應(yīng)注意到培養(yǎng)基占該容器的1/31/4為宜。6、封口。培養(yǎng)基分裝后，應(yīng)立刻用封口膜將容器口部封嚴(yán)。封口膜應(yīng)具有透光、透氣性，但不通透塵埃、微生物等雜質(zhì)。（四）培養(yǎng)基的滅菌組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境中進(jìn)行，因此作為外植體生長的介質(zhì)的培養(yǎng)基的

14、滅菌操作非常重要。培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。一般采用的是高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌的原理：通過加熱，在密閉的高壓鍋內(nèi)隨著水蒸汽壓力的不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.105MPa壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度乃熱的芽孢。一般情況下，滅菌在溫度121，壓力0.105MPa下，保持2030min即可。滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中手提式高壓蒸汽滅菌鍋是最常用的，但是在使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空間，利于蒸汽流動(dòng)；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響滅菌效果；4、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間；5