HPLC_UV法定量測定發(fā)酵液中的S_腺苷_L_甲硫氨酸

1、中國生物工程雜志China B i otechnol ogy, 2007, 27(11 :7376HP LC 2UV 法定量測定發(fā)酵液中的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸蔡恒鄭偉剛?cè)f紅貴3郭一丹王濤(南京工業(yè)大學制藥與生命科學學院南京210009摘要采用高效液相色譜2紫外檢測器(HP LC 2UV 定量測定發(fā)酵液中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸(S AM 的含量。結(jié)果表明, S 2腺苷2L 2甲硫氨酸濃度在0. 11. 0g/L時, 其峰面積(Y 與相應的濃度(X 呈線性關(guān)系, 線性方程為Y =13. 937X -0. 1949, 相關(guān)系數(shù)為0. 9969。S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的平均回收率為99.

2、 89%101. 7%, 相對標準偏差為0. 48%1. 36%。該方法精密度、, 穩(wěn)定性高, 能簡便、快速、準確地測定發(fā)酵液中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的含量。關(guān)鍵詞S 2腺苷2L 2甲硫氨酸HP LC UV 中圖分類號Q815收稿日期:2007205229修回日期:20072092243通訊作者, 電子信箱:lubinnewt om. comS 2腺苷2L 2甲硫氨酸(S 2adenosyl 2L 2methionine 體內(nèi)的重要中間活性物質(zhì), 硫基作用。有增, 需求量很大, 。S 2苷2L 2甲硫氨酸主要通過發(fā)酵法生產(chǎn), S 2腺苷2L 2甲硫氨酸測定方法的文獻不是分離效果不理想, 就

3、是流動相價格昂貴。本文嘗試采用一種新的流動相, 建立S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的HP LC 2UV 定量分析方法, 為發(fā)酵液中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的含量測定提供一種簡單、快速、準確的方法。1材料與方法1. 1儀器高效液相色譜儀(A lltech , 包括426HPLC 泵, UV2000檢測器等; TG L 216G 冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠 ; BS124S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司 , LG 冰箱。1. 2試劑乙腈(色譜純, Caledon Laboratories 公司 , S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準品(Sig ma 公司 , 三氟乙酸(AR, 國藥集團化學

4、試劑有限公司 , 七氟丁酸(AR, Fluka 公司 ,Q 純水機制備。色譜條件色譜柱:Prevail C 18(250mm ×4. 6mm , 5m 流動相:0. 14%三氟乙酸(含0. 06%七氟丁酸 溶液2乙腈溶液(8020 流速:0. 8m l/min 檢測器:UV A lltech 波長:254nm 進樣量:20l 溫度:251. 4樣品溶液的配制S 2腺苷2L 2甲硫氨酸發(fā)酵液經(jīng)4000r/min 的速率離心10m in 后, 取菌體用等體積20%的高氯酸萃取1. 5h, 在4000r/min 的速率離心10m in, 取上清液經(jīng)0. 22m 水膜過濾后待用。1. 5標準

5、溶液的配制S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準品25mg 全部用超純水溶解, 振蕩并定容至10ml, 得到濃度為2. 5g/L的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準品儲備液。然后分別制得質(zhì)量濃度為0. 1g/L、0. 4g/L、0. 5g/L、0. 8g/L、1. 0g/L,所用水均為超純水。2結(jié)果與討論2. 1色譜條件的選擇S 2腺苷2L 2甲硫氨酸分子中有共軛雙鍵, 有紫外吸 中國生物工程雜志China B i otechnol ogy Vol. 27No. 112007收, 可以直接使用紫外檢測器檢測。根據(jù)S 2腺苷2L 2甲硫氨酸分子結(jié)構(gòu), 查有關(guān)資料, 它的最大吸收波長為254nm 。關(guān)于S A

6、M 的檢測方法都是HPLC 2UV , 但是流動相和柱子的選用有所不同。揚州大學蔡瑞4是以甲酸銨(甲酸調(diào)pH 值到4. 0 為流動相, 陽離子色譜柱, 但是檢測時間太長, 并且分離度不好; 浙江工業(yè)大學陳小龍5以甲酸銨(甲酸調(diào)pH 值到3. 0 為流動相, 反相C 218拄, 但是同樣存在檢測時間太長的問題; 浙江大學趙曉星6是以40mmol/L磷酸二氫銨2mmol/L庚烷磺酸鈉18%(V /V 甲醇水溶液當流動相, C 218色譜柱, 檢測方法好, 但是流動相原料庚烷磺酸鈉價格昂貴, 不易采用。本實驗起始用甲醇/水當流動相, 有機相的比例從100%開始, 每次遞減20%, 但是效果也不理想。

7、以已腈/水當流動相, 體積比為1000、9010、8020、7030的0. 14%三氟乙酸(含0. 06%七氟丁酸 溶液2乙腈溶液作為流動相進行實驗。同時采用不同的流速, 分別為0. 8m l/min, 1. 0m l/min, 1. 2m l/min, 1. 6m l/min 進行實驗, 結(jié)果表明, 體積比為8020時, 流速為0.8m l/min 時S 2腺苷2L 2甲離, 色譜峰保留時間短, 峰形良好, , 能, 采用252. 2在1. 3, 對5種不同濃度的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準溶液進樣, 以S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準品濃度為橫坐標, 相應的峰面積/106為縱坐標, 以最小

8、二乘法進行線性回歸, 得標準曲線, 如圖1所示。其標準曲線方程為Y =13. 937X +0. 1949, 相關(guān)系數(shù)r=0. 9969, 線性范圍為0. 11. 0g /L。 圖1S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的標準曲線F i g . 1Ca li bra ti on curve of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e2. 3精密度和重復性對0. 4g /L的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸標準溶液經(jīng)6次平行測定, 測定結(jié)果如表1所示。S 2腺苷2L 2甲硫氨酸含量的相對標準偏差為1. 32%, 表明該方法精密度良好。對同一發(fā)酵液樣品溶液經(jīng)6次平行測定, 測定結(jié)果如表2所

9、示。S 2腺苷2L 2甲硫氨酸含量的相對標準偏差0. 69%, 表明該方法重復性良好。表1S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的精密度測定結(jié)果Table 1Prec isi on of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e測定值/(g /L平均值/(g /L 標準偏差RS D /%0. 40370. 39690. 41320. 40870. 40750. 40970. 40660. 00541. 32表2S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的重復性測定結(jié)果Table 2Reproduc i b ility of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e測定值/(

10、g /L平均值/(g /L 標準偏差RS D /%0. 20140. 20150. 20100. 19890. 19900. 20080. 200040. 00140. 692. 4穩(wěn)定性0h 、2h 、10h , 測定結(jié)果如表3所S 2L 1. 6%, 12h 以內(nèi)穩(wěn)定性良好。表3S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 3St ab ility of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e測定值/(g /L平均值/(g /L 標準偏差RS D /%0. 31050. 31550. 31020. 31180. 30050. 31260. 31020. 0

11、0511. 62. 5回收率將一定含量的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸發(fā)酵液樣品溶液分成3組, 每組3份。每組分別加入低、中、高三種濃度的標準溶液, 在1. 3節(jié)規(guī)定的色譜條件下進樣。樣品的平均回收率為99. 89%101. 7%, 相對標準偏差為0. 48%1. 36%(表4 , 表明該方法準確可靠。表4S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的回收率測定結(jié)果Table 4Recover i es of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e組號添加量/g 測得量/g 回收率/%平均回收率/%RS D /%10. 280. 282100. 7101. 71. 360. 280. 28

12、5101. 80. 280. 288102. 820. 650. 654100. 699. 890. 770. 650. 64699. 380. 650. 64899. 6930. 820. 81599. 3999. 930. 480. 820. 823100. 30. 820. 821100. 12. 6樣品的測定分別將S 2腺苷2L 2甲硫氨酸發(fā)酵液樣品溶液和標準47 2007, 27(11蔡恒等:HP LC 2UV 法定量測定發(fā)酵液中的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸溶液進樣測定, 標準溶液和樣品溶液的色譜圖如圖2所示。由圖可知, 樣品溶液中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸色譜峰與雜質(zhì)峰完全分離,

13、標準溶液和樣品溶液中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的保留時間分別為12. 721m in 、12. 503m in,保留時間短, 可達到快速檢測的目的。根據(jù)S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的標準曲線方程, 按外標法計算可得樣品中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的含量。 圖2標準溶液和發(fā)酵液樣品的色譜圖F i g . 2Chro ma togram s of the st andard(aand the s am ple(b3結(jié)論本文通過HP LC 2UV 色譜條件的選擇, 建立了使用HPLC 2UV 定量測定發(fā)酵液中的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的方法。結(jié)果表明, 最佳HPLC 2UV 色譜條件如下, 流動相為

14、體積比8020的0. 14%三氟乙酸(含0. 06%七氟丁酸 溶液2乙腈溶液, 流速為0. 8m l/min, 紫外檢測器的波長為254nm 。該方法操作簡單快速, 穩(wěn)定性高, 精密度、準確度好, 可滿足發(fā)酵液中的S 2腺苷2L 2甲硫氨酸定量分析要求。該方法也可用于S 2腺苷2L 2甲硫氨酸分離純化過程中S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的含量測定, 為發(fā)酵法生產(chǎn)S 2腺苷2L 2甲硫氨酸的整個工藝過程提供了可靠的檢測手段。參考文獻1李東陽, 于健, 田露, 等. 利用重組P ichia pastoris 生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸. 生物工程學報, 2002, 18(3 :295299L i D Y, Yu

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18、ss of Its Stable Salts . Hang Zhou:Zhejiang University College of Materials Sccience and Che m icalEngineering, 200657 中國生物工程雜志China B i otechnol ogy Vol. 27No. 112007D etecti on of S 2Adenosyl 2L 2m eth i on i n e i n Fer m en t a ti on L i qu i d by HPLC 2UVCA I Heng Z HE NG W ei 2gang WAN Hong 2g

19、ui G UO Yi 2dan WANG Tao(College of Phar macy and L ife Science, Nanjing University of Technol ogy, Nanjing 210009, China Abstract A method f or the deter m inati on of S 2Adenosyl 2L 2methi onine in fer mentati on liquid using the high perfor mance liquid chr o mat ography coup led with UV detect o

20、r (HP LC 2UV was devel oped . A g ood linearity was obtained in the range of 0. 11. 0g/L(r =0. 9969 f or S 2Adenosyl 2L 2methi onine . The average recoveries of S 2Adenosyl 2L 2methi onine were 99. 89%101. 7%and the relative standard deviati ons were 0. 48%1. 36%.The method is si m p le and rap id with rep r oducibility for the deter m inati on of S 2Adenosyl 2L 2methi onine in fer ment liquid .Key words S 2Adenosyl 2L 2methi onine HP LC UV科學出版社精品圖書基因I X (原版書 Benja m in Le win 著幾十年來, Benjam in Le win 的經(jīng)典著作基因容, 包括基因結(jié)構(gòu)、測序、組織和表達?；騃 X 表觀遺傳學效應”一章, 是業(yè)已出版的最前沿、。比