漢灘病毒S基因免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的初步觀察

1、漢灘病毒S基因免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的初步觀察漢灘病毒S基因免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的初步觀察病毒學(xué)報(bào) 2000年第3期第16卷 論著人與動(dòng)物病毒作者：張夢華王航雁楊為松黃長形李光玉汪毅白雪帆單位：張夢華（衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心，北京 100050）；王航雁（中國人民解放軍301醫(yī)院，北京 100853）；楊為松黃長形李光玉汪毅白雪帆（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院， 陜西 西安 710038）關(guān)鍵詞：漢灘病毒；基因免疫；S片段編碼區(qū)基因；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞摘要：將漢灘病毒S片段編碼區(qū)基因插入到含CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子（promoterenhancer）的真核表達(dá)載體pVR1012中，構(gòu)建成

2、真核表達(dá)質(zhì)粒pVRS22。質(zhì)粒DNA經(jīng)純化后，注射經(jīng)布比卡因預(yù)處理的Balbc小鼠的股四頭肌，多次免疫后，免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測結(jié)果顯示：免疫鼠的脾細(xì)胞能夠?qū)w外抗原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)；CTL活性檢測結(jié)果表明：靶細(xì)胞51Cr的釋放是效應(yīng)細(xì)胞依賴性的，并且與病毒感染組的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性相似。結(jié)果顯示，用重組質(zhì)粒pVRS22免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性（CTL）。中圖分類號：R37332 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：10008721（2000）03-0219-04Plasmid DNA Expressing Hantaan Virus S Gene

3、 Induces Cellular Immunity Responses in MiceZHANG Meng-hua（National Center for AIDS Prevention and Control, Ministry of Health， Beijing 100050, China）wANG Hang-yan（301th Hospital of PLA, Beijing 100853, China）yANG Wei-song，HUANG Chang-xing，LI Guang-yu，WANG Yi，BAI xue-fan（Tangdu Hospital of the 4 th

4、Military University of PLA, Xian 710038, China）Abstract: Hantaan virus S segment coding region gene was inserted into the eukaryotic expression vector pVR1012 under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter/enhancer. The recombinant plasmid DNA, designated as pVRS22 were purified with PEG. Then

5、Balb/c mice were immunized with purified pVRS22 by intramuscular injection at intervals of three weeks for 9 weeks. The lymphoproliferative responses of spleen cells from pVRS22 plasmid injected mice clearly showed that these cells were able to proliferate in the presence of Hantaan virus. The CTL a

6、ctivities of spleen cells from pVRS22 DNA-vaccinated mice were tested with different effector to target ratios. The results demonstrated that the release of chromium from target cells was an effector cell depended phenomenon and were similar to the CTL activities of mice infected with Hantaan virus.

7、 Our results showed that specific cell mediated immunity responses were elicited in the pVRS22 vaccinated mice. The lymphoproliferative responses and CTL activity of spleen cells from pVRS22 plasmid vaccinated mice were significant and successful.Key words: Hantaan virus; gene immunization; S segmen

8、t coding region gene; cytotoxicT lymphocyte (CTL) ; recombinant plasmid腎綜合征出血熱（HFRS）是一類由漢坦病毒1引起的以發(fā)熱、出血和急性腎功能損傷為特征的急性傳染病。目前HFRS在全球的流行有發(fā)展擴(kuò)大的趨勢，并不斷有新的血清型和新的宿主動(dòng)物被發(fā)現(xiàn)，因此，HFRS疫苗對于控制HFRS病毒感染和疾病的發(fā)生具有重要意義。漢灘病毒核蛋白由S基因編碼，由于核蛋白能夠誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答2，因此在保護(hù)機(jī)體免受漢灘病毒感染、清除病毒等方面具有與糖蛋白（誘導(dǎo)中和抗體）同樣重要的意義，所以核蛋白作為漢灘病毒疫苗的重要組成部分，受到廣泛重

9、視。90年代初，DNA免疫研究獲得成功3，為傳統(tǒng)的疫苗研究開辟了新的領(lǐng)域。DNA免疫是以DNA質(zhì)粒直接接種于體內(nèi)，目的基因經(jīng)表達(dá)、翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫的過程。DNA免疫具有操作簡單、費(fèi)用低廉、免疫效果全面等特點(diǎn)，因此正成為當(dāng)今疫苗研究的熱點(diǎn)。特別是DNA免疫在流感病毒、HIV、HBV46等病原研究方面的成功資料，也為漢灘病毒DNA疫苗的研究提供了經(jīng)驗(yàn)。本文應(yīng)用含漢灘病毒S片段編碼區(qū)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVRS22免疫小鼠，對免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答（脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖功能和CTL活性）進(jìn)行了初步研究。材料與方法1質(zhì)粒和宿主菌質(zhì)粒pBVS22為漢灘病毒核蛋白

10、原核表達(dá)質(zhì)粒，含漢灘病毒S片段編碼區(qū)基因，由本室黃長形博士惠贈(zèng)7。質(zhì)粒pVR1012由美國Vical公司惠贈(zèng)，為含有CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子的真核表達(dá)載體。宿主菌TG1由本室保存。2酶與試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自Promega公司、Boehringer Mannheim公司及華美生物工程公司。MEM培養(yǎng)基為美國Gibco產(chǎn)品。小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。L谷氨酰胺為美國Sigma產(chǎn)品。3H胸腺嘧啶核苷（3Hthymidine，簡稱3HTdR）購自中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所。Na251CrO4（酪酸鈉）為美國杜邦公司產(chǎn)品。3動(dòng)物Balbc（H2d）純系小白鼠，雌性，68周，由第四軍醫(yī)大

11、學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。4pVRS22質(zhì)粒DNA的制備、純化和免疫小鼠pVRS22質(zhì)粒的構(gòu)建及大量制備均按分子克隆8進(jìn)行，經(jīng)PEG純化，作為免疫用DNA。動(dòng)物免疫按文獻(xiàn)9進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組小鼠被分成3組，每組5只，先在小鼠股四頭肌注射100l含0.25的布比卡因（bupivacaine）和01的對羥基苯甲酸甲酯（methylparaban）做預(yù)處理，24h后，按100g劑量接種pVRS22質(zhì)粒及空白載體pVR1012，每隔3周加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次，每次免疫均按上述同樣程序進(jìn)行。每次免疫前，采小鼠尾靜脈血，留血清用于漢灘病毒抗體的檢測（見另文）。陽性對照以漢灘病毒A9株腹腔免疫小鼠，每只106稀釋的漢

12、灘病毒A9株感染乳鼠的鼠腦懸液002ml，3周后加強(qiáng)注射1次。陽性對照組、陰性對照組（為不進(jìn)行任何免疫的正常小鼠）和空載體組均為5只。小鼠經(jīng)最后一次免疫后10天，取脾淋巴細(xì)胞，測定特異性T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能（CTL）。5免疫小鼠特異性淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測應(yīng)用3HTdR摻入法對免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖功能進(jìn)行檢測。按文獻(xiàn)10進(jìn)行。無菌分離每只免疫動(dòng)物的脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)無菌尼龍毛柱分離T淋巴細(xì)胞。用10FCS的MEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至107ml，以100l孔加入96孔板內(nèi)，并同時(shí)加入30l 106稀釋的紫外滅活的漢灘病毒感染的乳鼠鼠腦懸液作為抗原體外刺激，每份樣品做3復(fù)孔，37

13、5CO2培養(yǎng)72h后，每孔加入3HTdR2l（1ci2l），繼續(xù)孵育12h，收集樣品于濾膜上，烘干，浸于閃爍液中，于Backman 液閃儀計(jì)數(shù)，增殖水平直接用cpm表示，增殖指數(shù)以SI來表示。各組以每份標(biāo)本平均值標(biāo)準(zhǔn)差(SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以每組最終的平均值SD作為結(jié)果。6免疫小鼠細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能檢測（CTL試驗(yàn)）采用4h51Cr釋放試驗(yàn)檢測，參照文獻(xiàn)11如下：將分離的1107淋巴細(xì)胞與5105個(gè)病毒感染的同系小鼠的巨噬細(xì)胞，37 5CO2培養(yǎng)5天，使淋巴細(xì)胞活化，此即為效應(yīng)細(xì)胞。以05PFU細(xì)胞的漢灘病毒A9株感染同系Balbc小鼠的腹腔滲出細(xì)胞（PECs），培養(yǎng)5天，IFA染色，

14、80100的PEC細(xì)胞含有病毒抗原時(shí)，用胰酶消化，用MEM調(diào)細(xì)胞濃度為4106ml，取05ml細(xì)胞，加入100ci Na251CrO4，37孵育2h進(jìn)行標(biāo)記，此即為51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。將靶細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100l，設(shè)3復(fù)孔，以不同比例加入效應(yīng)細(xì)胞，每孔加入100l，最大釋放組加入100l 1 Triton X-100，自然釋放組加入100l培養(yǎng)基。375CO2培養(yǎng)4h。每孔取100l上清，計(jì)數(shù)儀測cpm值。結(jié)果以CTL殺傷率表示，各組以每份標(biāo)本平均值SD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以每組最終的平均值作為結(jié)果。結(jié)果1pVRS22重組質(zhì)粒的構(gòu)建真核表達(dá)載體pVR1012經(jīng)Pst酶切，Klen

15、ow酶補(bǔ)平，Sal酶切，回收大片段，即為載體片段。pBVS22經(jīng)EcoR酶切，Klenow酶補(bǔ)平，Sal酶切，回收小片段，兩個(gè)回收片段經(jīng)平粘連接，獲重組質(zhì)粒pVRS22（圖1）。酶切鑒定分析見圖2。2免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能檢測結(jié)果pVRS22實(shí)驗(yàn)組、空載體pVR1012組、A9株感染組的脾細(xì)胞體外用紫外滅活的漢灘病毒A9株進(jìn)行刺激。正常小鼠的脾細(xì)胞用未經(jīng)感染的同系小白鼠脾細(xì)胞進(jìn)行刺激。體外刺激后48h、72h、96h分別測定其脾細(xì)胞的3HTdR摻入水平（cpm），結(jié)果以每組小鼠平均cpm值SD來表示(圖3)，另計(jì)算其刺激指數(shù)，刺激指數(shù)實(shí)驗(yàn)組cpm值正常對照cpm值。體外刺激后不同時(shí)限的刺激指

16、數(shù)見圖4。3特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞功能檢測結(jié)果從圖5可以看出：隨著E：T比值的增大，效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷力也增大。漢灘病毒A9株感染鼠在E：T為100時(shí)其殺傷率為77534，而pVRS22質(zhì)粒免疫鼠為621231，空白載體pVR1012組幾乎無殺傷活性。從中可以看出，pVRS22質(zhì)粒免疫鼠具有較好的殺傷活性。圖1pVRS22質(zhì)粒構(gòu)建圖Figure 1Construction of the pVRS22 expression plasmid圖2pVRS22重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切分析Figure 2The restriction analysis of pVRS22 recombinant p

17、lasmid1pBR322MsPI marker，2BamH，3PstSal，4Hind，5Pvu，6DNAHind marker圖3淋巴細(xì)胞增殖功能檢測Figure 3Detection of lymphoproliferation response圖4淋巴細(xì)胞增殖功能檢測Figure 4Detection of lymphoproliferation response圖5不同E：T比值測定的實(shí)驗(yàn)鼠CTL特異殺傷結(jié)果Figure 5The specific CTL activity of experimental mice detected by defferent E：T ratio討論C

18、D8T細(xì)胞作為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，在識別位于保守部位的內(nèi)源性病毒蛋白的抗原表位的同時(shí)，與有核細(xì)胞（包括專業(yè)APC）表面的MHC類分子結(jié)合，激活后增殖分化為特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，以溶解殺傷病毒感染細(xì)胞，清除體內(nèi)病毒。漢灘病毒的核蛋白作為內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)抗原，其抗原性極強(qiáng)，用核蛋白免疫動(dòng)物，被免疫動(dòng)物對病毒攻擊有很好的保護(hù)作用2，11。Asada11、詹發(fā)先12等先后研究發(fā)現(xiàn)，不同血清型腎綜合征出血熱病毒免疫后產(chǎn)生的CTL之間存在有交叉免疫反應(yīng)，同型不同株之間有較多的CTL識別位點(diǎn)，兩型毒株間也有共同的CTL識別位點(diǎn)，核蛋白的這些特性，為研究核蛋白的免疫保護(hù)作用提供了重要理論依據(jù)。我們將編碼核蛋白

19、（NP）抗原的基因S片段編碼區(qū)克隆至一真核表達(dá)載體pVR1012中，構(gòu)建了NP DNA重組表達(dá)質(zhì)粒pVRS22，以此DNA疫苗多次免疫小鼠后，分別測定了免疫小鼠的淋巴細(xì)胞的增殖功能及殺傷活性，結(jié)果獲得了有意義的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能測定的結(jié)果顯示，其增殖水平接近漢灘病毒A9株病毒感染小鼠，在一定的時(shí)限內(nèi)，增殖水平與細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間成正比。而空白載體pVR1012免疫鼠的淋巴細(xì)胞并不對體外抗原的再刺激發(fā)生增殖。這一結(jié)果提示：pVRS22 DNA質(zhì)粒免疫小鼠的淋巴細(xì)胞具有較好的增殖活性。對免疫組淋巴細(xì)胞殺傷功能的檢測得出了同樣有意義的結(jié)果，在免疫組15只免疫小鼠中，除1只小鼠未測到

20、明顯的殺傷活性外，其余14只小鼠均可測得不同程度的殺傷活性，其效靶比例的平均殺傷百分率略低于漢灘病毒A9株感染組小鼠，而且靶細(xì)胞51Cr的釋放具有效應(yīng)細(xì)胞依賴現(xiàn)象，隨著效應(yīng)細(xì)胞絕對數(shù)的增加，其殺傷率也增加。而pVR1012空載體免疫組幾乎未測出有殺傷活性。這一結(jié)果表明我們所構(gòu)建的NP DNA疫苗多次免疫小鼠后，核蛋白不僅在體內(nèi)得到表達(dá)，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生了由CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的CTL活性。我們首次應(yīng)用DNA免疫技術(shù)成功地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了針對漢灘病毒核蛋白的CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。進(jìn)一步評價(jià)免疫效果的被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)等方面的研究正在進(jìn)行之中，有望為今后漢灘病毒其它抗原的基因免疫研究提供更多的依據(jù)，也希望能

21、為今后腎綜合征出血熱疫苗的研究提供一條新的途徑。作者簡介：張夢華（1960），女，山西太原人，博士，現(xiàn)在中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院艾滋病預(yù)防與控制中心做博士后研究，研究方向?yàn)镠IV1感染者及艾滋病患者藥物治療前后藥物抗藥性的產(chǎn)生。參考文獻(xiàn)：1 Lee H W, Lee P W, Johnson K M, et al. Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic Fever J . J Infect Dis, 1978, 137 (3) : 298-308.2 Yoshimatsu K, Yco Y C, Yoshida R, et al

22、. Protective immunity of hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus expressed proteins J . Arch Virol, 1993, 130: 365-376.3 Wolff J A, Malone R W, Williams P, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo J . Science, 1990, 247: 1465-1468.4 Ulmer J B, Donnelly

23、J J, Parker S E, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein J . Science, 1993, 259: 1745-1749.5 Wang B, Ugn K E, Srikntn V, et al. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1 J. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 4156-4160.6 Davis H L, Michel M L, Mancini M, et al. Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the h