基因工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告(程慶佳-生物技術(shù)-20091070004)

1、大腸桿菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其檢測(cè)（基因工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告）程慶佳（云南大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)，20091070004）（班級(jí)：周二下午實(shí)驗(yàn)班; 組號(hào):第八組; 老師：賴建華； 同組員：顧聚）摘要：此次實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)大腸桿菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其檢測(cè)，其中的關(guān)鍵步驟包括了大腸桿菌基因DNA的提取，PCR擴(kuò)增，DNA體外重組，感受態(tài)細(xì)胞的制備，重組DNA的轉(zhuǎn)化，重組轉(zhuǎn)化的檢測(cè)等多種具有緊密連接性的實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生可以掌握一套具有連貫性的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，幫助學(xué)生塑造連貫試驗(yàn)的觀念，從而得到更好地成長(zhǎng)與進(jìn)步。關(guān)鍵詞：提取、擴(kuò)增、重組、感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化、檢測(cè)正文：此次實(shí)驗(yàn)的最終目的是要使學(xué)生連貫

2、性的掌握本學(xué)期的實(shí)驗(yàn)，所以要求我們要熟悉每個(gè)實(shí)驗(yàn)的原理過(guò)程，以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確分析，只有這樣才能保證實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，才能真正地掌握此次實(shí)驗(yàn)。1、 大腸桿菌基因組DNA的提取原理： DNA是一個(gè)環(huán)形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。不同種屬的生物，以及不同形式的細(xì)胞（如菌類、培養(yǎng)細(xì)胞、植物組織，動(dòng)物組織）基因組提取的方法是不同的，但其基本原則是類似的，即既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的

3、DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵受到破壞，失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可通過(guò)失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來(lái)。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，

4、從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類物質(zhì)分開(kāi)。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。簡(jiǎn)要步驟：（1）、菌種活化：將菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過(guò)夜（2）、取1ml菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，5000rpm離心1分鐘，去上清。（3）、加入500ulTE，50ul 10% SDS，5ul蛋白酶K，混勻，55度，保溫20min（4）、加入50ul，5M Nacl混勻，再加入50ul CTAB 提取液，混勻，65度，20min（5）、去蛋白：300ul的酚和氯仿，輕輕混勻，10000rpm，2min（6）、上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈的1.5ml離心

5、管，加入等體積氯仿異戊醇，輕輕混勻，10000rpm，2min，上清轉(zhuǎn)入干凈的1.5ml離心管中（7）、加入1/10體積的醋酸鈉，2倍體積的無(wú)水乙醇輕輕旋轉(zhuǎn)小試管，可見(jiàn)絮狀沉淀，即為染色體絲，10000qpm，3min收集沉淀（8）、棄上清，沉淀用500ul 75%乙醇洗滌兩次（每次10000rpm離心1min）（9）、室溫下稍干，加適量（約50ul）RTE溶解，37度 30min（10）、電泳觀察結(jié)果 1 2 如圖所示，1號(hào)為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)比maker,第一條帶為正常大腸桿菌基因組，中間可以看見(jiàn)模糊的條帶，可能為斷裂的基因組片段，下面最亮的為RNA。出現(xiàn)斷裂的基因組可能是由于操作過(guò)于劇烈。

6、本組電泳帶還比較清晰整齊，其他組不整齊的帶可能是電泳技術(shù)問(wèn)題。RNA含量很大，所以顯示比較清晰。在電泳過(guò)程中應(yīng)注意的是膠濃度要與DNA分子量呈線性關(guān)系，所以膠濃度對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)的成敗有重要的意義。另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免用力，以此來(lái)保障DNA樣品結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性。2、 PCR擴(kuò)增目的基因核糖核苷酸酶HII基因原理：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能在幾小時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作中，將人為選定的一段DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。PCR的工作原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過(guò)程，是將待擴(kuò)增的DNA

7、片斷和與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)變性、退火及延伸三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使特定的DNA片斷在數(shù)量上呈指數(shù)增加。PCR擴(kuò)增首先需要一對(duì)引物，根據(jù)待擴(kuò)增區(qū)域兩側(cè)的已知序列合成兩個(gè)與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴(kuò)增片段的特異性和片段長(zhǎng)度。反應(yīng)體系由模板DNA、一對(duì)引物、dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、酶反應(yīng)緩沖體系及必須的離子等所組成。PCR反應(yīng)循環(huán)的第一步為加熱變性，使雙鏈模板DNA變性為單鏈；第二步為復(fù)性，每個(gè)引物將與互補(bǔ)的DNA序列雜交；第三步為延伸，在耐高溫的DNA聚合酶作用下，以變性的單鏈DNA為模板，從引物3端開(kāi)始按53方向合成DNA鏈。這樣經(jīng)過(guò)一個(gè)周期的變性復(fù)性延伸

8、等三步反應(yīng)就可以產(chǎn)生倍增的DNA，假設(shè)PCR的效率為100%,反復(fù)n周期后，理論上就能擴(kuò)增2n倍。PCR反應(yīng)一般30-40次循環(huán)，DNA片段可放大數(shù)百萬(wàn)倍。常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴(kuò)增，變性溫度為95，復(fù)性溫度為3755，延伸合成溫度為72，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受95左右的高溫而不失活），反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30。簡(jiǎn)要步驟：（1）、在PCR管中加入所需試劑和樣品。（2）、將PCR管放入事先調(diào)好的PCR儀中，進(jìn)行PCR（3）、PCR后，對(duì)樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。 如圖所示，對(duì)比第一個(gè)條帶maker，右邊的條帶可以看到PCR進(jìn)行的較為成功，DNA條帶下并無(wú)明顯的其他條帶，所以DNA的純度較

9、高，并無(wú)雜質(zhì)RNA與蛋白。由樣品對(duì)比的明暗度可以看出，較為明亮的DNA含量較多，反之一樣。此次實(shí)驗(yàn)主要要求學(xué)生掌握PCR反應(yīng)儀的使用方法以及電泳反應(yīng)條帶的正確分析，從而得到正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3、 PMD-RNase HII DNA 體外重組 原理：DNA重組是指不同來(lái)源的DNA片段共價(jià)連接，通過(guò)重新組合，構(gòu)成了具有兩個(gè)DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。DNA體外重組技術(shù)是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增、成為克隆，這一過(guò)程稱為DNA體外重組技術(shù)。DNA體外重組技術(shù)是基

10、因工程的核心內(nèi)容。 DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。重組的DNA分子在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子和外源DNA分子進(jìn)行連。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性開(kāi)端的DNA分子連接在一起，而且能使平端的雙鏈DNA分子連接在一起，但平端連接的熱效率要比粘性末端連接效率低。 連接反應(yīng)溫度在37度時(shí)利于連接酶的活性，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定。一般的連接條件是12-16度，反應(yīng)12-16小時(shí)，這樣既可最大限度的發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)化菌

11、進(jìn)行篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒。簡(jiǎn)要步驟：（1）、10%瓊脂凝膠電泳，用6孔梳子做膠，將擴(kuò)增剩余產(chǎn)物全部上樣電泳。（2）、切膠，回收。加入400ul溶膠液Binding Buffer ，55度溶膠（3）、裝柱：將溶解好的溶液加入回收柱中，并將回收柱套入2ml廢液管中。（4）、12000rpm離心30秒，去除廢液。（5）、漂洗：將500ul漂洗液wash solution 加入回收柱中，并將回收柱重新套入2ml的廢液管中，12000rpm離心30秒，去除廢液（6）、重復(fù)漂洗一次去除廢液。（7）、12000rpm離心2min，將回收柱套入純凈無(wú)菌的1.5ml離心管（8）、向回收柱的正中央加20

12、ul洗脫buffer，50度放置15分鐘（9）、12000rpm離心2分鐘，1.5ml離心管底部的溶液即為回收的DNA 4 1 2 3 此電泳圖是PCR產(chǎn)物回收檢測(cè)的電泳圖，是為了檢測(cè)兩種試驗(yàn)樣品是否可以繼續(xù)使用，由圖中可以看到1號(hào)為對(duì)照條帶，2、3兩個(gè)樣品的條帶較為清晰，所以可以使用，并且4號(hào)為重復(fù)樣品。之后進(jìn)行2、3兩種樣品的切膠回收。 1 2 3 此圖中1號(hào)為對(duì)照條帶maker，2、3號(hào)為切膠回收樣品，樣品中沒(méi)有雜質(zhì)，樣品條帶較為模糊，表明回收的樣品含量較少，但是還可以勉強(qiáng)使用。 最后在小離心管中加入5ul膠回收的PCR產(chǎn)物，再加5ul solution I連接反應(yīng)液，加0.5ul的pm

13、d18-T Vector DNA，混勻后，于16度反應(yīng)30分鐘以上即為重組子。此次試驗(yàn)要求我們掌握切膠的過(guò)程，親自動(dòng)手進(jìn)行實(shí)踐，還使我們熟悉了重組子構(gòu)建的步驟與過(guò)程，熟悉DNA體外重組。4、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備原理：本次試驗(yàn)采用CaCl2制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。所謂的感受態(tài)，是指受體最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。Ca也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油或70度保存。簡(jiǎn)要步驟：

14、（1）、取凍存宿主菌一環(huán)，接于LB無(wú)抗平板培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)過(guò)夜（2）、取培養(yǎng)菌液1.5ml轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上冷卻10min，于4度，4000rpm離心5分鐘（3）、倒凈上清培養(yǎng)液，用750ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴10min（4）、4度，4000rpm離心5分鐘（5）、棄上清，加入500ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞。冰浴10min，4度，4000rpm離心5分鐘（6）、棄上清，加入50ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，放在冰上片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；凍存。 本次試驗(yàn)較為簡(jiǎn)單，主要是進(jìn)行重復(fù)的

15、CaCl2溶液的添加，之后離心處理，其中的關(guān)鍵在于冰浴溫度的控制以及無(wú)菌的操作條件，所以操作要快速并且保障準(zhǔn)確性，還要準(zhǔn)確計(jì)量時(shí)間。 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響因素 （1）細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹

16、配。 （2）質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。 （3）試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4。 （4）防止雜菌和雜

17、DNA的污染整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。（5）整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。本次實(shí)驗(yàn)要求我們要掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備程序，以及應(yīng)注意的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)，可以參考上面的五點(diǎn)注意事項(xiàng)，來(lái)嚴(yán)格的控制實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程，從而得到完好的感受態(tài)細(xì)胞，來(lái)進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)。5、 重組PMD-RNase HII DNA 的轉(zhuǎn)化原理：為了使重組DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增以及獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，需將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。重

18、組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化有多種方法，包括化學(xué)法，電激法，原生質(zhì)體融合法等，其中化學(xué)法又有好多種。本實(shí)驗(yàn)采用常用的CaCl2法。用冰預(yù)冷的氯化鈣溶液處理對(duì)數(shù)期細(xì)菌，使細(xì)胞膜通透性增加，宿主菌成為感受態(tài)，此時(shí)加入外源DNA，經(jīng)42度短暫熱處理后，外源DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，及少許液體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間后，將菌液涂布于固體培養(yǎng)及平板上，得到的菌落稱為轉(zhuǎn)化子或重組子。根據(jù)這一原理，可將外源質(zhì)粒DNA高效的導(dǎo)入大腸桿菌中去。簡(jiǎn)要步驟：（1）、分別取兩個(gè)50ul的感受態(tài)細(xì)胞懸液，第一組，加入全部重組質(zhì)粒DNA+50ul感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組；第二組，不加任何東西，作為空白對(duì)照。（

19、2）、將以上兩組樣品輕輕搖勻，冰上放置30分鐘，于42度水域中保溫1.5min，然后迅速冰上冷卻2min（3）、立即向上述管中分別加入0.2mlLB，20ulX-Gal和2ulIPTG，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37度震蕩培養(yǎng)約45min，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物。（4）、取轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液各0.1ml，分別接種于含抗菌素和不含抗菌素的LB培養(yǎng)基上；另取0.1ml空白對(duì)照組培養(yǎng)液涂布于一個(gè)抗生素的平板上，倒置培養(yǎng)，于37度培養(yǎng)箱過(guò)夜。（5）、觀察涂布生長(zhǎng)情況，記菌落數(shù)，判斷是否成功。如有白色菌落出現(xiàn)，是重組子。 此次試驗(yàn)主要基于感受態(tài)細(xì)胞的制備以及DNA體外

20、重組實(shí)驗(yàn)的重組子的基礎(chǔ)之上進(jìn)行的，使兩者結(jié)合在一起來(lái)進(jìn)行重組DNA的轉(zhuǎn)化，在涂布平板的過(guò)程中要嚴(yán)格的在無(wú)菌條件下進(jìn)行，并且要涂布均勻，還有在樣品制備過(guò)程中要注意冰浴和水域的溫度和時(shí)間，震蕩的時(shí)間與溫度，這些都關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。最后在恒溫培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)過(guò)夜后，在其中5個(gè)培養(yǎng)基中可清晰的看到白色菌落，這些白色菌落為重組子，所以此次試驗(yàn)結(jié)果較為明顯，實(shí)驗(yàn)較為成功。為下面的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了充足且良好的實(shí)驗(yàn)材料。6、 重組轉(zhuǎn)化子檢測(cè)技術(shù) 原理：在DNA體外重組實(shí)驗(yàn)中，外源DNA片段與載體DNA 的連接反應(yīng)一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，由于重組率和轉(zhuǎn)化率都不可能達(dá)到100%的理想極限，因此必須使用各種篩選與鑒定

21、的手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子、重組子和非重組子以及期望重組子和非期望重組子。 重組子的篩選方法較多，常用有：1.限制性酶切圖譜法：提取質(zhì)粒，酶切，電泳驗(yàn)證；2.抗藥性篩選法，插入失活；3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法；4.雜交法：原位雜交，Southern；5.測(cè)序；6.表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：測(cè)活、電泳、蛋白印跡等。 最終目的是篩選到有插入子的序列就成功了。簡(jiǎn)要步驟：（1）、培養(yǎng)細(xì)菌:將白色單菌落接入4ml含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)12-16個(gè)小時(shí)；（2）、取1.5ml菌體培養(yǎng)液于1.5mlEppendorf管中，6000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ul質(zhì)粒提取液1，充分混勻。（3）、加入200ul新配置的質(zhì)粒提取液2，加蓋顛倒多次使之混勻（4）、加入150ul質(zhì)粒提取液3，加蓋后顛倒多次混勻，冰上放置5分鐘（5）、加入等體積酚：氯仿：異戊醇混合物，用力震蕩搖勻（6）、13400rpm離心2min，上清移入另一干凈離心管。（7）、在上清中加入等體積氯仿：異戊醇混合物，混勻，13400rpm，2min，然后將上清轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中。（8）、在上清中加2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，12000rpm離心2min，棄去上清液。（9）、沉淀加75%乙醇洗滌一次，清洗時(shí)輕輕來(lái)回顛倒幾次即可，勿使沉淀浮起，用槍頭